Tríade catalítica

Unha tríade catalítica é un conxunto de tres aminoácidos coordinados que se poden encontrar no sitio activo dalgúns encimas.^[1][2] As tríades catalíticas encóntranse máis comunmente en encimas hidrolases e transferases (por exemplo, proteases, amidases, esterases, acilases, lipases e β-lactamases). Unha tríada formada por ácido-base-nucleófilo é un motivo común para xerar un residuo nucleófilo para a catálise covalente. Os residuos de aminoácidos forman unha rede de relevo de carga para polarizar e activar o nucleófilo, o cal ataca o substrato, formando un intermediario covalente que é despois hidrolizado para liberar o produto e rexenerar o encima libre. O nucleófilo adoita ser unha serina ou cisteína, pero ocasionalmente é unha treonina ou mesmo unha selenocisteína. A estrutura tridimensional do encima fai que os residuos da tríade estean xuntos e cunha orientación precisa, incluso se ditos residuos están moi afastados na estrutura primaria do encima.^[3]

Ademais de teren unha evolución diverxente na función (e incluso no nucleófilo da tríade), as tríades catalíticas son algúns dos mellores exemplos de evolución converxente. As restricións químicas sobre a catálise conduciron á mesma solución catalítica que evolucionou independentemente en polo menos 23 superfamilias de proteínas.^[2] O seu mecanismo de acción é, en consecuencia, un dos mellores estudados en bioquímica.^[4][5]

Os encimas tripsina e quimotripsina foron purificados na década de 1930 por primeira vez.^[6] Na década de 1950 identificouse que unha serina na tripsina e quimotripsina era o nucleófilo catalítico (por modificación de diisopropil fluorofosfato).^[7] Resolveuse a estrutura da quimotripsina por cristalografía de raios X na década de 1960, que mostrou a orientación da tríade catalítica no sitio activo.^[8] Secuenciáronse outras proteases e alineáronse descubrindo unha nova familia de proteases relacionadas,^[9][10][11] agora chamada familia S1. Simultaneamente, descubriuse que as estruturas das proteases non relacionadas evolutivamente papaína e subtilisina conteñen tríades análogas. O mecanismo de 'relevo de carga' (charge-relay) para a activación do nucleófilo polos outros membros da tríade propúxose a finais da década de 1960.^[12] A medida que se foron resolvendo máis estruturas de protease por cristalografía de raios X nas décadas de 1970 e 80, foron atopándose tríades homólogas (como a da protease TEV) e análogas (como a da papaína).^[13][14][15] O sistema de clasificación MEROPS nas décadas de 1990 e 2000 empezou a clasificar as proteínas en superfamilias de encimas estruturalmente relacionados e funciona como unha base de datos da evolución converxente das tríades nunhas 20 superfamilias.^[16][17] Comprender como as restricións químicas na evolución levaron a que se producise esta converxencia de tantas familias de encimas nas mesmas xeometrías de tríades foi un traballo que se desenvolveu ao longo da década de 2010.^[2]

Desde o seu descubrimento inicial, houbo un número crecente de investigacións detalladas sobre cal era o mecanismo catalítico exacto. Un asunto especialmente discutido durante os anos 90 e 2000 foi se os enlaces de hidróxeno de barreira baixa contribuían á catálise,^[18][19][20] ou se o enlace de hidróxeno ordinario era suficiente para explicar o mecanismo.^[21][22] A gran cantidade de traballos realizados sobre o relevo de carga, fixo que a catálise covalente utilizada polas tríades catalíticas sexa o mecanismo mellor coñecido en toda a bioquímica.^[4][5][21]

Os encimas que conteñen unha tríade catalítica úsana para un destes dous tipos de reaccións: para a rotura hidrolítica dun substrato (hidrolases) ou para transferir unha porción dun substrato sobre un segundo substrato (transferases). As tríades son un conxunto interdependente de residuos do sitio activo dun encima e actúan concertadamente con outros residuos (por exemplo, os do sitio de unión e do burato de oxianión) para conseguir unha catálise necleofílica. Estas tríades actúan xuntas para facer que o membro nucleófilo sexa altamente reactivo, xerando un intermediario covalente co substrato que é despois procesado ata a súa completa catálise.^{[Cómpre referencia]}

As tríades catalíticas realizan unha catálise covalente usando un residuo de aminoácido como nucleófilo. A reactividade do residuo nucleófilo increméntase polos grupos funcionais doutros membros da tríade. O nucleófilo é polarizado e orientado pola base, a cal á súa vez é estabilizada polo ácido.^{[Cómpre referencia]}

A catálise realízase en dúas etapas. Primeiro, o nucleófilo activado ataca o carbono do carbonilo e forza o oxíxeno do carbonilo a aceptar un par electrónico, orixinando un intermediario tetraédrico. A acumulación de carga negativa neste intermediario é tipicamente estabilizada por un burato de oxianión do sitio activo. O intermediario despois colápsase de novo a carbonilo, exectando a primeira metade do substrato, pero deixando a segunda metade aínda unida covalentemente ao encima como un intermediario acil-encima. Aínda que a catálise xeral ácida para a rotura do primeiro e segundo intermediarios tetraédricos pode ocorrer pola vía mostrada no diagrama, as probas que apoian este mecanismo para a quimotripsina^[23] son controvertidas.^[24]

A segunda etapa da catálise é a resolución do intermediario acil-encima polo ataque dun segundo substrato. Se este substrato é a auga, entón o resultado é unha hidrólise; pero se é unha molécula orgánica, entón o resultado é a transferencia desa molécula ao primeiro substrato. O ataque por este segundo substrato forma un novo intermediario tetraédrico, que se resolve ao exectar o nucleófilo do encima, liberando o segundo produto e rexenerando o encima libre.^[25]

A cadea lateral do residuo nucleófilo realiza unha catálise covalente sobre o substrato. O par solitario de electróns presente no oxíxeno ou xofre ataca o carbono do carbonilo electropositivo.^[3] Os 20 aminoácidos que aparecen nas proteínas non conteñen ningún grupo funcional suficientemente nucleofílico para realizar moitas reaccións catalíticas difíciles. Que o nucleófilo estea incluído nunha tríade incrementa a súa reactividade para facilitar unha catálise eficaz. Os nucleófilos utilizados máis correntemente son o hidroxilo (OH) da serina e o tiol/ión tiolato (SH/S⁻) da cisteína.^[2] Alternativamente, as treonina proteases usan o hidroxilo secundario da treonina, aínda que debido aos impedimentos estéricos do seu grupo metilo extra da cadea lateral tales proteases usan a súa amida N-terminal como base, en vez douto aminoácido.^[1][26]

O uso de oxíxeno ou xofre como átomo nucleófilo causa pequenas diferenzas na catálise. Comparado co oxíxeno, o orbital d extra do xofre faino uns 0,4 Å máis grande^[27] e menos forte, o que lle permite formar enlaces máis longos (d_C-X é 1,3 veces maior que d_X-H), e dálle un menor pK_a (5 unidades máis).^[28] A serina é, por tanto, máis dependente que a cisteína da orientación óptima dos membros da triade ácido-base para reducir o seu pK_a^[28] para conseguir unha desprotonación concertada coa catálise.^[2] O baixo pK_a da cisteína supón unha desvantaxe na resolución do primeiro intermediario tetraédrico, xa que a reversión improdutiva do ataque nucleófilo orixinal é o produto da rotura máis favorable.^[2] A base da tríade está, por tanto, orientada preferentemente a protonar o grupo saínte amida para asegurar que é exectado para deixar o xofre do encima enlazado covalentemente ao N-terminal do substrato. Finalmente, a resolución do acil-encima (para liberar o C-terminal do substrato)) precisa serina para ser reprotonado, mentres que a cisteína pode saír como S⁻. estericamente o xofre da cisteína tamén forma enlaces máis longos e ten un radio de van der Waals maior^[2] e se muta a unha serina pode quedar atrapado en orientacións improdutivas no sitio activo.^[27]

Moi raramente utilízase como nucleófilo un átomo de selenio do aminoácido pouco común selenocisteína.^[29] O estado desprotonado do Se⁻ está fortemente favorecido cando forma parte da tríade catalítica.^[29]

Como ningún aminoácido natural é fortemente nucleofílico, a base dunha tríade catalítica polariza e desprotona o nucleoófilo para incrementar a súa reactividade.^[3] Ademais, protona o primeiro produto para axudar á expulsión do grupo saínte.^{[Cómpre referencia]}

A base adoita ser a histidina, xa que o seu pK_a permite unha efectiva catálise básica, a formación de enlaces de hidróxeno co residuo ácido e a desprotonación do residuo nucleóflo.^[1] As β-lactamases como a TEM-1 usan como base un residuo de lisina. Como o pK_a da lisina é moi alto (pK_a=11), un glutamato e outros varios residuos actúan como ácido para estabilizar o seu estado desprotonado durante o ciclo catalítico.^[30][31] As treonina proteases usan a súa amida N-terminal como base, porque o ateigamento estérico do metilo da súa treonina catalítica impide que outros residuos estean o suficientemente próximos.^[32][33]

O membro ácido da tríade forma un enlace de hidróxeno co residuo básico. Isto alinea o residuo básico ao restrinxir a rotación da súa cadea lateral e polarízao ao establizar a súa carga positiva.^[3] Hai dous aminoácidos que teñen cadeas laterais ácidas a pH fisiolóxico (aspartato e glutamato) e por iso son os máis utilizados como membros ácidos da tríade.^[3] A protease de citomegalovirus ^[b] usa un par de histidinas, unha como base, como é habitual, e outra como ácido.^[1] A segunda histidina non é un ácido tan eficaz coma os máis comúns aspartado ou glutamato, o que orixina unha menor eficacia catalítica. Nalgúns encimas o membro ácido da tríade é menos necesario e algúns actúan só como unha díade. Por exemplo, a papaína^[c] usa asparaxina como terceiro membro da tríade que orienta a base histidina, pero non actúa como ácido. De xeito similar, a protease do virus da hepatite A ^[d] contén unha molécula de auga ordenada na posición onde debería haber un residuo ácido.^{[Cómpre referencia]}

O motivo serina-histidina-aspartato é un dos motivos catalíticos mellor caracterizados en bioquímica.^[3] Esta tríade é exemplificada pola quimotripsina,^[e] un modelo de serina protease da superfamilia PA que usa a súa tríade para hidrolizar esqueletos peptídicos. O aspartato está unido por un enlace de hidróxeno por unha histidina, incrementando o pK_a do seu nitróxeno do imidazol desde 7 ata arredor de 12. Isto permite que a histidina actúe como unha poderosa base xeral e active o nucleófilo serina. Tamén ten un burato de oxianión que consta de varias amidas do esqueleto peptídico que estabilizan a acumulación de carga nos intermediarios. A base histidina axuda ao primeiro grupo saínte ao doar un protón, e tamén activa o substrato hidrolítico auga ao retirar un protón cando o restante OH⁻ ataca o intermediario acil-encima.^{[Cómpre referencia]}

A mesma tríade tamén evolucionou converxentemente nas α/β hidrolases como as lipases e esterases, pero a orientación dos membros da tríade está invertida.^[34][35] Ademais, a acetil hidrolase cerebral (que ten o mesmo pregamento que unha pequena proteína G) ten tamén esta tríade. A tríade equivalente Ser-His-Glu aparece na acetilcolinesterase.^{[Cómpre referencia]}

A segunda tríade mellor estudada é o motivo cisteína-histidina-aspartato.^[2] Varias familias de cisteína proteases usan este conxunto como tríade, por exemplo a protease TEV ^[a] e a papaína.^[c] A tríade actúa de modo similar ás tríades de serina protease, con poucas diferenzas salientables. Debido ao baixo pK_a da cisteína, a importancia do Asp para a catálise varía e varias cisteína proteases son en realidade díades Cys-His (por exemplo, a protease do virus da hepatite A), mentres que noutras a cisteína está xa desprotonada antes de que empece a catálise (por exemplo na papaína).^[36] Algunhas amidases utilizan tamén esta tríade, como a N-glicanase para hidrolizar enlaces C-N non peptídicos.^[37]

A tríade da protease do citomegalovirus ^[b] utiliza a histidina como membro ácido e básico da tríade. Retirar a histidina ácida ten como resultado un perda de actividade, que se divide por 10, (comparado cun aumento de >10000 cando se retira o aspartato da quimotripsina). Esta tríade foi interpretada como unha vía posible de xerar un encima menos activo que sirva para controlar a velocidade de clivaxe.^[26]

Unha tríade pouco común é a que se encontra nas seldolisina proteases.^[f] O baixo pK_a do grupo carboxilato do glutamato significa que só actúa como unha base na tríade a pH moi baixo. Hipotetízase que a tríade é unha adaptación a ambientes específicos como as fontes termais ácidas (por exemplo, a kumamolisina) ou o lisosoma da célula (por exemplo, a tripeptidil peptidase).^[26]

A protease endotelial vasohibina^[g] usa unha cisteína como nucleófilo, pero unha serina para coordinar a base histidina.^[38][39] A pesar de que a serina ten pouco carácter de ácida, é de todos modos efectiva para orientar a histidina da tríade cataltica.^[38] Algúns homólogos teñen alternativamente unha treonina en vez de serina na posición do ácido.^[38]

As treonina proteases, como a subunidade protease do proteosoma^[h] e ornitina aciltransferases^[i] usan o hidroxilo secundario da treonina de maneira análoga ao uso do hidroxilo primario da serina.^[32][33] Porén, debido á interferencia estérica do grupo metilo extra da treonina, o membro que fai de base na tríade é a amida N-terminal, que polariza unha molécula ordenada de auga, a cal, á súa vez, desprotona o hidroxilo catalítico para incrementar a súa reactividade.^[1][26] De maneira similar, existen configuracións equivalentes de 'só serina' e 'só cisteína', como as da penicilina acilase G^[j] e a penicilina acilase V^[k] que están evolutivamente relacionadas coas proteases do proteosoma. Unha vez máis, estas usan as súas amidas N-terminais como base.^[26]

Esta tríade pouco común aparece só nunha superfamilia de amidases. Neste caso, a lisina actúa polarizando a serina do medio.^[40] A serina situada no medio forma despois dous fortes enlaces de hidróxeno coa serina nucleofílica para activala (unha coa cadea lateral hidroxilo e a outra coa amida do esqueleto peptídico). Os enlaces de hidróxeno da serina central están nunha orientación pouco común cis para facilitar contactos precisos cos outros dous residuos da tríade. A tríade é tamén peculiar porque a lisina e a cis-serina actúan ambas como base que activa a serina catalítica, pero a mesma lisina tamén realiza o papel de membro ácido da tríada así como establece contactos estruturais clave.^[40][41]

O aminoácido pouco común, pero natural selenocisteína (Sec), pode tamén faacer de nucleófilo nalgunhas tríades catalíticas.^[29] A selenocisteína é similar á cisteína, pero contén un átomo de selenio en lugar dun xofre. Un exemplo é o sitio activo da tiorredoxina redutase, a cal usa o selenio para a redución do disulfuro na tiorredoxina.^[29]

Ademais dos tipos de tríades catalíticas que aparecen na natureza, a enxeñaría de proteínas foi utilizada para crear variantes de encimas con aminoácidos non nativos ou mesmo aminoácidos completamente sintéticos.^[42] As tríades catalíticas foron tamén inseridas en proteínas que non eran orixinalmente catalíticas^[43] ou en imitacións de proteínas.^[44]

A subtilisina (unha serina protease) foi modificada substituíndo o seu nucleófilo oxíxeno con xofre,^[45][46] ou selenio,^[47] ou telurio.^[48] A cisteína e a selenocisteína foron inseridas por mutaxénese, mentres que o aminoácido non natural telurocisteína foi inserido usando células auxotróficas alimentadas con telurocisteína sintética. Estes elementos químicos están todos na 16ª columna da táboa periódica (a dos calcóxenos), así que teñen propiedades similares.^[49][50] En cada caso, cambiar o nucleófilo reducía a actividade de protease do encima, pero incrementaba outra actividade diferente. Un nucleófilo xofre melloraba a actividade de transferase dos encimas (ás veces chamada subtiligase). Os nucleófilos selenio e telurio convertían o encima nunha oxidorredutase.^[47][48] Cando o nucleófilo da protease TEV era cambiado de cisteína a serina, a súa actividade de protease quedaba fortemente reducida, pero podía restaurarse por evolución dirixida.^[51]

Utilizando proteínas non catalíticas como armazóns, inseríronse tríades catalíticas nelas, que foron despois melloradas por evolución dirixida. Inseriuse a tríade Ser-His-Asp nun anticorpo,^[43] e tamén noutras diversas proteínas.^[52] Igualmente, creáronse imitacións da tríade catalítica en pequenas moléculas orgánicas como o diaril diseleniuro,^[53][54] e dispostos en polímeros máis grandes como as resinas Merrifield,^[44] e nanoestruturas péptidos curtos autoensamblados.^[55]

A sofisticación da rede de residuos que forma este sitio activo fixo que os residuos implicados na catálise (e os residuos en contacto con eles) estean moi conservados evolutivamente.^[56] Porén, tamén hai exemplos de evolución diverxente nas tríades catalíticas, tanto na reacción catalizada coma nos residuos usados na catálise. A tríade segue sendo o núcleo do centro activo, mais adaptouse evolutivamente para realizar diferentes funcións.^[57][58] Algunhas proteínas, chamadas pseudoencimas, non teñen funcións catalíticas (por exemplo, realizan regulación por unión inhibitoria) e acumularon mutacións que inactivaron as súas tríades catalíticas.^[59]

As tríades catalíticas realizan unha catálise covalente por medio dun intermediario acil-encima. Se este intermediario é resolto pola auga, o resultado é a hidrólise do substrato. Pero se o intermediario é resolto polo ataque dun segundo substrato, entón o encima actúa como transferase. Por exemplo, o ataque por un grupo acilo ten como resultado unha reacción de aciltransferase. A partir de hidrolases evolucionaron varias familias de encimas transferases por adaptación para excluír a auga en favor do ataque por un segundo substrato.^[60] En diferentes membros da superfamilia das α/β-hidrolases, a tríade Ser-His-Asp é axustada polos residuos que a rodean para realizar polo menos 17 reaccións distintas segundo o caso.^[35][61] Algunhas destas reaccións tamén se conseguen con mecanismos que alteraron a formación ou resolución do intermediario acil-encima, ou que non se realizan por medio dun intermediario acil-encima.^[35]

Adicionalmente, un mecanismo de transferase alternativo evolucionou nas amidofosforribosiltransferases, as cales teñen dous sitios activos.^[l] No primeiro sitio activo, unha tríade de cisteína hidroliza un substrato glutamina para liberar amoníaco libre. O amoníaco entón difunde a través dun túnel interno do encima ata chegar ao segundo sitio activo, onde é transferido a un segundo substrato.^[62][63]

A evolución diverxente de residuos de sitios activos é lenta, debido a fortes restricións químicas. Non obstante, algunhas superfamilias de proteases evolucionaron pasando dun nucleófilo a outro. Isto pode inferirse cando unha superfamilia (co mesmo pregamento) contén familias que usan diferentes nucleófilos.^[51] Tales cambios de nucleófilos ocorreron varias veces durante a historia evolutiva; porén o mecanismo polo cal isto acontece aínda non está claro.^[17][51]

Dentro das superfamilias de proteases que conteñen unha mestura de nucleófilos (por exemplom o clan PA), as familias desígnanse polo seu nucleófilo catalítico (C=cisteína proteases, S=serina proteases).

Outra subclase de variantes da tríade catalítica son os pseudoencimas, que teñen mutacións na tríada que os fan inactivos cataliticamente, pero poden funcionar como proteínas que se unen a outras ou son estruturais.^[65][66] Por exemplo, a proteína que se liga á heparina azurocidina é membro do clan PA, pero cunha glicina en lugar do nucleófilo e unha serina en lugar da histidina.^[67] De xeito similar, a RHBDF1 é un homólogo das proteases romboides da familia S54 cunha alanina no sitio do nucleófilo serina.^[68][69] Nalgúns casos, os pseudoencimas poden ter unha tríade catalítica aínda intacta pero sufriron mutacións no resto da proteína que suprimiron a súa actividade catalítica. O clan CA contén membros inactivos cataliticamente con tríades mutadas (a calpamodulina ten lisina en lugar do seu nucleófilo cisteína) e con tríades intactas pero mutacións inactivantes noutras partes (a testina de rata conserva a tríade Cys-His-Asn).^[70]

Converxencia evolutiva das serina e cisteína proteases cara á mesma organización das tríades catalíticas de ácido-base-nucleófilo en diferentes superfamilias proteicas. Móstranse as tríades da subtilisina,^[m] prolil oligopeptidase,^[n] protease TEV,^[a] e papaína.^[c] (PDB 1ST2)

Converxencia evolutiva das treonina proteases cara a unha mesma organización do sitio activo N-terminal. Móstranse a treonina catalítica do proteosoma^[h] e a ornitina acetiltransferase.^[i] (PDB 1VRA)

A encimoloxía das proteases proporciona algúns dos máis claros exemplos de evolución converxente. O mesmo arranxo xeométrico dos residuos da tríade aparece nunhas 20 superfamilias de encimas distintas. Cada unha destas superfamilias é o resultado da evolución converxente que deu lugar ao mesmo arranxo da tríade dentro dun pregamento estrutural diferente. Isto débese a que os modos produtivos para colocar os tres residuos da tríade, o esqueleto peptídico do encima e o substrato son limitados. Estes exemplos reflicten as restricións químicas e físicas que teñen os encimas, que os levan a evolucionar converxendo de forma repetida e independentemente en solucións equivalentes.^[1][2]

Tamén se observa unha converxencia na xeometría da tríade en serina proteases como nas superfamilias da quimotripsina^[e] e subtilisina. Unha evolución converxente similar ocorreu coas cisteína proteases como nas superfamilias da protease C3 viral e da papaína^[c]. Estas tríades converxeron case a un mesmo arranxo da tríade debido ás semellanzas no mecanismo da proteólise con cisteína e serina.^[2]

Familias de cisteína proteases

Familias de serina proteases

As treonina proteases usan o aminoácido treonina como nucleófilo catalitico. A diferenza da cisteina e serina, a treonina é un hidroxilo secundario (é dicir, ten tamén un grupo metilo). Este grupo metilo restrinxe grandemente as posibles orientacións da tríade e o substrato, xa que o metilo choca co esqueleto peptídico do encima ou coa base histidina.^[2] Cando o nucleófilo dunha serina protease muta a treonina, o metilo ocupa diversas posicións, a maioría das cales impiden a unión do substrato.^[71] En consecuencia, o residuo catalítico dunha treonina protease está localizado no seu N-terminal.^[2]

Sábese que dúas superfamilias de encimas evolutivamente independentes con diferentes pregamentos da proteína usan o residuo N-terminal como nucleófilo, que son: superfamilia PB (proteosomas que usan o pregamento Ntn)^[32] e superfamilia PE (acetiltransferases que usan o pregamento DOM)^[33] Esta semellanza na estrutura do sitio activo en pregamentos proteicos completamente diferentes indica que o sitio activo evolucionou converxentemente en ditas superfamilias.^[2][26]

Familias de treonina proteases

• Sitio activo
• Evolución converxente
• Evolución diverxente
• Catálise encimática
• Superfamilia de encimas
• Grupos funcionais
• Clan PA
• Protease
• Proteólise