[go: up one dir, main page]
Wikipedia

Micromatriz de ADN

(Redirección desde «Micromatrices de ADN»)
Sinónimos
  • Micromatrices
  • Microarray de ADN
  • DNA microarray
  • Microarranxo de ADN
  • Oligonucleótido array
  • Micromatriz de ADN
  • Gene chip
  • ADN array
  • Arranxo de ADN
  • Biochips de ADN

Unha micromatriz de ADN (DNA microarray), tamén chamada chip de ADN ou biochip de ADN ou microarranxo de ADN, é unha superficie sólida á que se unen un conxunto de "puntos" (sitios, manchas) microscópicos (spots ou features na literatura inglesa) que levan fragmentos de ADN. Os científicos usan estas micromatrices para medir os niveis de expresión dun gran número de xenes simultaneamente ou para xenotipificar múltiples rexións dun xenoma. Cada unha destas "manchas" con ADN contén picomoles (10−12 moles) dunha secuencia de ADN específica, chamada sonda (probe ou reporteiros ou oligos). Estas secuencias poden ser un curto fragmento dun xene ou outro elemento de ADN que se utiliza para hibridalo a unha mostra "diana" (target) de ADNc ou ARNc (tamén chamado ARN antisentido). A hibridación entre a sonda e a diana xeralmente detéctase e cuantifícase porque a diana detectada está etiquetada cun fluoróforo ou con prata ou con quimioluminescencia, o que serve para determinar a abundancia relativa da secuencia do ácido nucleico na diana.

Unha das súas principais aplicacións é identificar xenes cunha expresión diferencial en condicións distintas. Por exemplo, para detectar xenes que producen certas doenzas comparando os niveis de expresión entre células sas e células que están desenvolvendo certos tipos de doenzas.

A micromatriz básica

editar
 
Exemplo de chip de ADN con 40.000 sondas.

Como unha matriz (array) pode conter decenas de miles de sondas, un experimento cunha micromatriz (microarray) pode realizar moitas probas xenéticas en paralelo. Por tanto, o uso destas matrices acelerou drasticamente moitos tipos de investigacións. Nas micromatrices estándar as sondas son sintetizadas e despois unidas por medio de enxeñaría de superficie a unha superficie sólida por enlace covalente a unha matriz química (por medio de epoxi-silano, amino-silano, lisina, poliacrilamida ou outros). A superficie sólida pode ser vidro ou un chip de silicio, e nese caso denomínanse coloquialmente chip Affy se se utiliza un chip Affymetrix. Outras plataformas de micromatrices, como Illumina, utilizan boliñas, en vez de soportes sólidos grandes. Alternativamente, poden construírse micromatrices por síntese directa de sondas de oligonucleótidos en superficies sólidas. As matrices de ADN diferéncianse doutros tipos de micromatrices só en que ou ben miden o ADN ou usan o ADN como parte do seu sistema de detección.

As micromatrices de ADN poden utilizarse para medir cambios nos niveis de expresión para detectar polimorfismos dun só nucleótido (SNPs), ou para xenotipificar ou resecuenciar unha molécula diana. As micromatrices tamén se diferencian na súa fabricación, funcionamento, exactitude, eficiencia, e custo. Outros factores adicionais nos experimentos con micromatrices son o deseño experimental e os métodos de análise dos datos.

Principio

editar
 
Hibridación da diana coa sonda.

O principio fundamental das micromatrices é a hibridación entre dúas febras de ADN, grazas á propiedade que teñen as secuencias de ADN complementarias de aparearse especificamente unha con outra formando enlaces de hidróxeno entre pares de bases nucleotídicas complementarias. Se hai un elevado núumero de pares de bases complementarias nunha secuencia nucleotídica, vaise producir un enlazamento non covalente máis forte entre as dúas febras. Despois de facer un lavado que arrastre as secuencias que non teñan especificidade de enlace, só quedarán hibridadas as febras fortemente apareadas. As secuencias diana etiquetadas flourescentemente que se unen a unha secuencia de sonda xeran un sinal que depende das condicións de hibridación (como a temperatura), e o lavado despois da hibridación. A forza total do sinal xerado desde un dos "puntos" ou "sitios" da micromatriz (spot, feature), depende da cantidade de mostra diana que se una ás sondas presentes nese "punto". As micromatrices usan unha cuantización relativa na cal se compara a intensidade dun destes "puntos" (feature) coa intensidade do mesmo "punto" en diferentes condicións (ver tamén os experimentos de dous canais máis abaixo) e a identidade do "punto" coñécese pola súa posición.

 
Pasos necesarios nun experimento de micromatrices.

Tipos

editar
 
Dous chips Affymetrix. Pode verse unha correspondencia no fondo á esquerda para comparar o tamaño.

Existen moitos tipos de matrices e a maior distinción que se pode facer entre elas é se están dispostas espacialmente sobre unha superficie ampla ou en boliñas codificadas:

  • A matriz de fase sólida tradicional é unha colección de "puntos" ordenados microscopicamente, chamados features, cada unha con miles de sondas específicas idénticas unidas a unha superficie sólida, como un vidro, plástico ou biochip de silicio (xeralmente coñecido por chip xenómico, chip de ADN ou matriz de xenes). Poden situarse miles destas en localizacións coñecidas nunha soa micromatriz de ADN.
  • A matriz de boliñas alternativa é unha colección de boliñas de polistireno microscópicas, cada unha das cales leva unha sonda específica e dúas ou máis marcaxes, que non interfiren coa marcaxe fluorescente usada na secuencia diana.

As principais técnicas de micromatrices de ADN son:

Micromatrices de dous canais (ou dúas cores)

editar
 
Diagrama dun experimento típico de chip de ADN con dobre canal.

Neste tipo de chips de ADN (en inglés spotted microarrays), as sondas son oligonucleótidos, ADN complementario (ADNc) ou pequenos fragmentos de reacción en cadea da polimerase, que corresponden a ARN mensaxeiros. Neste tipo de chip de ADN utilízanse preparacións de ADNc obtido a partir de dúas mostras biolóxicas distintas; por exemplo, de células cultivadas en dúas condicións distintas. O ADNc de cada mostra márcase cun fluoróforo diferente, e as dúas preparacións de ADNc marcadas mestúranse e hibridan sobre o mesmo chip de ADN. Unha vez realizado este primeiro paso, procédese ao escaneo do resultado e á visualización do mesmo. Desta forma pódense detectar xenes que se activan ou se reprimen en distintas condicións. A contrapartida destes experimentos é que non se poden observar niveis absolutos na expresión e requiren PCR cuantitativa (qPCR) para unha análise cuantitativa absoluta.

Chips de oligonucleótidos de ADN

editar

Nos chips de oligonucleótidos de ADN ou micromatrices de canal único, as sondas deséñanse a partir dunha secuencia coñecida ou dun ARNm predito. Estes chips de ADN dan estimacións do nivel de expresión, mais nunha mesma matriz non se poden observar distintas condicións, polo que hai que utilizar un chip para cada condición.

A idea principal desta técnica é que as sondas se sintetizan in situ (no chip).

Non están baseados na hibridación competitiva, é dicir, un chip, unha mostra. As secuencias constrúense na superficie do chip mediante o alongamento secuencial dunha cadea en crecemento cun só nucleótido utilizando fotolitografía.

GeneChips de Affymetrix

editar
  • Affymetrix é a compañía líder neste tipo de chips.
  • Denomínanse xenericamente "GeneChips".
  • Cada xene é representado por un conxunto de secuencias curtas que o caracterizan.
  • Algúns chips teñen xenomas completos con máis de 50.000 grupos de sondas.

Chips de ADN para xenotipificación

editar

Os chips de ADN poden utilizarse para "ler" as secuencias dun xenoma en determinadas posicións. As matrices de SNP (SNP arrays) son un tipo particular de matrices que se utilizan para identificar variacións individuais e nas poboacións. Os oligonucleótidos pequenos poden identificar polimorfismos dun só nucleótido (SNPs, single nucleotide polymorphisms) que poderían ser os responsables das variacións xenéticas dentro dunha poboación, e a fonte de susceptibilidade a distintas enfermidades xenéticas e mesmo a certos tipos de cancro. En xeral, a aplicación destas técnicas de xenotipificación ou xenotipado é o uso forense e o médico, xa que son rápidas para descubrir ou medir a predisposición a doenzas ou mesmo permitir o uso de certos medicamentos para tratar determinadas doenzas segundo sexa o ADN do doente ou doante. Os chips de ADN de SNPs tamén se utilizan para a identificación de mutacións somáticas en cancros, sobre todo a perda de heterocigose, a amplificación ou a deleción de rexións de ADN no xenoma individual de pacientes afectados, é dicir, a detección de aberracións cromosómicas.

Aplicacións

editar

As micromatrices de ADN poden utilizarse para detectar ADN (como na hbridación xenómica comparativa), ou detectar ARN (xeralmente en forma de ADNc despois de facer unha transcrición inversa), o cal pode ser ARN que é traducido a proteínas ou non. O proceso de medir a expresión xénica por medio de ADNc denomínase análise de expresión ou perfil de expresión.

As principais aplicacións son:

Aplicación ou tecnoloxía Sinopse
Perfil de expresión xénica Nun experimento de perfil de ARNm ou de expresión xénica monitorízanse simultaneamente os niveis de expresión de miles de xenes para estudar os efectos de certos tratamentos, doenzas, e estadios de desenvolvemento sobre a expresión xénica. Por exemplo, o perfil de expresión xénica baseado en micromatrices pode usarse para identificar aqueles xenes cuxa expresión cambia en resposta a patóxenos ou outros organismos en comparación coas células non infectadas, ou en estados de enfermidade en comparación co estado san.[1]
Hibridación xenómica comparativa Avalía o contido do xenoma en diferentes células ou en organismos estreitamente relacionados.[2][3]
GeneID Son pequenas micromatrices para comprobar os IDs de organismos en mostras de alimentos (como en OMX [1]), micoplasmas en cultivo celular, ou patóxenos para detectar doenzas, principalmente combinando a PCR coa tecnoloxía de micromatrices.
Inmunoprecipitación de cromatina sobre chip (ChIP-on-chip) Poden illarse secuencias de ADN unidas a unha determinada proteína inmunoprecipitando esa proteína (ChIP); estes fragmentos poden despois hibridarse a unha micromatriz (como o tiling array), o que permite a determinación da ocupación dos sitios de unión ás proteínas por todo o xenoma. Exemplos de proteínas que se inmunoprecipitan son as modificacións de histonas (H3K27me3, H3K4me2, H3K9me3 etc.), as proteínas do grupo Polycomb (PRC2:Suz12, PRC1:YY1) e as proteínas do grupo trithorax (Ash1) para estudar a paisaxe epixenética, ou a ARN polimerase II para estudar a paisaxe de transcrición.
DamID Analogamente ao ChIP, poden illarse rexións xenómicas ás que se une unha proteína de interese e utilizar unha sonda nunha micromatriz para determinar a ocupación do sitio de unión. A diferenza da ChIP, o DamID non require anticorpos pero fai uso da metilación da adenina preto dos sitios de unión da proteína para amplificar selectivamente ditas rexións, que se introduce expresando pequenas cantidades da proteína de interese fusionadas ao encima bacteriano ADN adenina metiltransferase.
Detección de SNP Identificación de polimorfismos dun só nucleótido (SNP) entre alelos nunha poboación ou entre poboacións.[4] Hai varais aplicacións das micromatrices que fan uso da detección de SNP, como a xenotipificación, análises forenses, medición da predisposición xenética a unha doenza, identificación de candidatos a fármacos, avaliación de mutacións na liña xerminal en individuos ou mutacións somáticas en cancros, avaliar a perda de heterocigose, ou a análise de ligamento xenético.
Detección de splicing alternativo Un deseño de matriz da zona de unión de exóns (exon junction array) usa sondas específicas para os sitios de empalme potenciais ou esperados de exóns preditos para un xene. É de densidade ou cobertura intermedia, con respecto a unha matriz de expresión xénica típica (con de 1 a 3 sondas por xene) e un tiling array xenómico (con centos ou miles de sondas por xene). Utilízase para probar a expresión de formas de splicing alternativo dun xene. As matrices de exóns teñen un deseño diferente, e empregan sondas deseñadas para detectar cada exón individual para xenes preditos ou coñecidos, e pode utilizarse para detectar diferentes isoformas de splicing.
Micromatriz de xenes de fusión Unha micromatriz de xenes de fusión pode detectar transcritos de fusión, por exemplo, de mostras de cancro. Baséase nas micromatrices de splicing alternativo. A estratexia de deseño de oligos permite combinar as medidas de zonas de unión de transcritos quiméricos con medidas de exóns de compañeiros de fusión individuais.
Tiling array Os tiling arrays xenómicos (literalmente matrices "de tellas ou baldosas") consisten en sondas solapadas deseñadas para representar densamente unha rexión xenómica de interese, ás veces tan grande coma un cromosoma humano completo. O propósito é detectar empiricamente a expresión de transcritos ou formas producidas por splicing alternativo, que poderían non ter sido preditas ou coñecidas previamente. É útil para caracterizar rexións que xa foron secuenciadas, pero das que non se coñecen moitas das funcións locais.

Fabricación

editar
Un robot imprimindo unha micromatriz de ADN na Universidade de Delaware.

As micromatrices poden fabricarse de diferentes xeitos, dependendo do número de sondas a examinar, custos, requirimentos de personalización, e o tipo de cuestión científica que se vai examinar. As matrices poden ser de só 10 sondas ou de ata 2,1 millóns de sondas a escala micrométrica vendidas comercialmente. É normal o uso de robots que se encargan da maior parte do proceso de manipulación dos chips (sintetizar o ADN molde que se une ao chip, unilo, engadir os reactivos necesarios etcétera).

O chip é unha placa pequena de arredor de 6 cm x 3 cm sobre a cal se fixan as febras monocatenarias (en lugar das bicatenarias habituais) de ADN, cada un correspondente a unha febra complementaria de ARN mensaxeiro. Poden fixarse sobre un chip varias decenas de miles de fragmentos de ADN.

As sondas deposítanse sobre a lámina de maneira similar á dunha impresora de inxección de tinta. Desta maneira, un brazo robótico con múltiples agullas mergúllase primeiro en pociños que conteñen as sondas (preparadas previamente) e despois deposita ringleiras de diminutas pinguiñas dunha solución de ADN en posicións específicas do chip. Deste conxunto de ringleiras vén o nome de microarray ou micromatriz. O ADN é despois secado e tratado de maneira que quede fixado ao chip. Esta "grella" ou retícula bidimensional de ringleiras e columnas ou micromatriz de sondas do tipo spotted microarray xa está preparada para recibir as dianas derivadas das mostras que se queren analizar.

As micromatrices de oligonucleótidos fabrícanse xeralmente doutra maneira, xa que as sondas se sintetizan nucleótido a nucleótido na superficie da propia matriz (en vez de depositar sondas previamente formadas).

Micromatrices e bioinformática

editar
 
Os valores de expresión xénica dos experimentos de micromatrices poden representarse como mapas de calor para visualizar o resultado das análises de datos.

A chegada da tecnoloxía dos experimentos de micromatrices baratos orixinou varios retos bioinformáticos:

  • Os múltiples niveis de replicación no deseño experimental (deseño experimental).
  • O número de plataformas e grupos independentes e formatos de datos (estandarización).
  • O tratamento dos datos (análise estatística).
  • A exactitude e precisión (relación entre a sonda e o xene)
  • O enorme volume de datos e a capacidade de compartilos (almacenamento de datos).

Tecnoloxías alternativas

editar

Os avances na secuenciación en paralelo masiva levaron ao desenvolvemento da tecnoloxía RNA-Seq, que permite utilizar unha estratexia de escopeta de transcriptoma completo para caracterizar e cuantificar a expresión xénica.[5][6] A diferenza das micromatrices, que necesitan dispoñer dun xenoma e transcriptoma de referencia antes de facer o experimento de micromatrices propiamente dito, a tecnoloxía RNA-Seq pode usarse tamén para novos organismos modelo cuxos xenomas aínda non foron secuenciados.[6]

Historia

editar

A tecnoloxía de micromatrices evolucionou desde a técnica do Southern blot, na que o ADN fragmentado está unido a un substrato e despois é sondado cunha secuencia de ADN coñecida.[7] O primeiro informe do uso deste enfoque técnico foi a análise de 378 colonias bacterianas lisadas en matriz, cada unha das cales levaba unha diferente secuencia, a cal era probada en múltiples réplicas para a expresión de xenes en tecido tumoral e normal múltiple.[8] Isto foi ampliado despois a unha análise de máis de 4000 secuencias humanas con computador con escaneo e procesamento de imaxes para a análise cuantitativa das secuencias en tumores de colon humanos e tecidos normais,[9] e despois para comparar tecidos de colon con diferentes riscos xenéticos.[10] O uso dunha colección de diferentes ADNs en matrices para obter un perfil de expresión foi tamén descrito en 1987, e os ADNs en matriz foron utilizados para identificar xenes cuxa expresión está modulada polo interferón.[11] Estas matrices de xenes iniciais fixéranse colocando "puntos" con ADNc en papel de filtro cun aparato. Os primeiros informes sobre o uso de micromatrices miniaturizadas para obter perfís de expresión xénica fixéronse en 1995,[12] e en 1997 publicouse o exame en micromatrices dun xenoma eucariota completo (de Saccharomyces cerevisiae).[13]

Notas

editar
  1. ↑ Adomas A; Heller G; Olson A; Osborne J; Karlsson M; Nahalkova J; Van Zyl L; Sederoff R; Stenlid J; Finlay R; Asiegbu FO (2008). "Comparative analysis of transcript abundance in Pinus sylvestris after challenge with a saprotrophic, pathogenic or mutualistic fungus". Tree Physiol. 28 (6): 885–897. PMID 18381269. doi:10.1093/treephys/28.6.885. 
  2. ↑ Pollack JR; Perou CM; Alizadeh AA; Eisen MB; Pergamenschikov A; Williams CF; Jeffrey SS; Botstein D; Brown PO (1999). "Genome-wide analysis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays". Nat Genet 23 (1): 41–46. PMID 10471496. doi:10.1038/14385. 
  3. ↑ Moran G; Stokes C; Thewes S; Hube B; Coleman DC; Sullivan D (2004). "Comparative genomics using Candida albicans DNA microarrays reveals absence and divergence of virulence-associated genes in Candida dubliniensis". Microbiology 150 (Pt 10): 3363–3382. PMID 15470115. doi:10.1099/mic.0.27221-0. 
  4. ↑ Hacia JG; Fan JB; Ryder O; Jin L; Edgemon K; Ghandour G; Mayer RA; Sun B; Hsie L; Robbins CM; Brody LC; Wang D; Lander ES; Lipshutz R; Fodor SP; Collins FS (1999). "Determination of ancestral alleles for human single-nucleotide polymorphisms using high-density oligonucleotide arrays". Nat Genet 22 (2): 164–167. PMID 10369258. doi:10.1038/9674. 
  5. ↑ Mortazavi, Ali; Brian A Williams; Kenneth McCue; Lorian Schaeffer; Barbara Wold (xullo de 2008). "Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq". Nat Meth 5 (7): 621–628. ISSN 1548-7091. PMID 18516045. doi:10.1038/nmeth.1226. Consultado o 2009-03-13. 
  6. ↑ 6,0 6,1 Wang, Zhong; Mark Gerstein; Michael Snyder (xaneiro de 2009). "RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics". Nat Rev Genet 10 (1): 57–63. ISSN 1471-0056. PMC 2949280. PMID 19015660. doi:10.1038/nrg2484. Consultado o 2009-03-13. 
  7. ↑ Maskos, U; Southern, EM (11 Apr 1992). "Oligonucleotide hybridizations on glass supports: a novel linker for oligonucleotide synthesis and hybridization properties of oligonucleotides synthesised in situ". Nucleic Acids Res. (Maskos U, Southern EM) 20 (7): 1679–84. PMC 312256. PMID 1579459. doi:10.1093/nar/20.7.1679. 
  8. ↑ Augenlicht LH; Kobrin D (1982). "Cloning and screening of sequences expressed in a mouse colon tumor". Cancer Research 42 (3): 1088–1093. PMID 7059971. 
  9. ↑ Augenlicht; Wahrman, MZ; Halsey, H; Anderson, L; Taylor, J; Lipkin, M (1987). "Expression of cloned sequences in biopsies of human colonic tissue and in colonic carcinoma cells induced to differentiate in vitro". Cancer Research 47 (22): 6017–6021. PMID 3664505. 
  10. ↑ Augenlicht; et al. (1991). "Patterns of Gene Expression that Characterize the Colonic Mucosa in Patients at Genetic Risk for Colonic Cancer". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88 (8): 3286–3289. doi:10.1073/pnas.88.8.3286. 
  11. ↑ Kulesh DA; Clive DR; Zarlenga DS; Greene JJ (1987). "Identification of interferon-modulated proliferation-related cDNA sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (23): 8453–8457. PMC 299562. PMID 2446323. doi:10.1073/pnas.84.23.8453. 
  12. ↑ Schena M; Shalon D; Davis RW; Brown PO (1995). "Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray". Science 270 (5235): 467–470. PMID 7569999. doi:10.1126/science.270.5235.467. 
  13. ↑ Lashkari DA; DeRisi JL; McCusker JH; Namath AF; Gentile C; Hwang SY; Brown PO; Davis RW (1997). "Yeast microarrays for genome wide parallel genetic and gene expression analysis". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (24): 13057–13062. PMC 24262. PMID 9371799. doi:10.1073/pnas.94.24.13057. 

Véxase tamén

editar

Outros artigos

editar

Ligazóns externas

editar
Traído desde «https://gl.wikipedia.org/w/index.php?title=Micromatriz_de_ADN&oldid=6836248»