Bacterial display

A bacterial display, tamén chamada bacteria display ou bacterial surface display (que se pode traducir^[1] por exhibición en bacterias ou exhibición na superficie de bacterias) é unha técnica de enxeñaría de proteínas usada para dirixir a evolución de proteínas in vitro na que as proteínas quedan exhibidas ou expostas na superficie de bacterias. As bibliotecas de polipéptidos exhibidas na superficie da bacteria poden ser examinadas utilizando citometría de fluxo ou procedenmentos de selección iterativa (biocribado). Esta técnica de enxeñaría de proteínas permite ligar a función da proteína coa do xene que a codifica. A bacterial display pode utilizarse para encontrar proteínas diana coas propiedades desexadas e tamén para producir ligandos de afinidde que son específicos de célula. Este sistema ten moitas aplicacións como a creación de novas vacinas, a identificación de substratos encimáticos ou encontrar a afinidade dun ligando pola súa proteína diana.

A bacterial display está a miúdo acoplada coa selección de células activada magneticamente (MACS) ou a selección de células activada por fluorescencia (FACS). Outros métodos que compiten nos traballos de evolución de proteínas in vitro son a phage display, a ribosome display, a yeast display e a mRNA display. O sistema de display máis común é a phage display, que utiliza bacteriófagos,^[2] aínda que a bacterial display está facéndose cada vez máis popular a medida que se van superando os seus retos técnicos. A bacterial display combinada con FACS ten tamén a vantaxe de que é unha técnica en tempo real.

Os sistemas de display foron utilizados por primeira vez en 1985, cando péptidos fusionados xeneticamente con proteíns foron exhibidos na superficie do bacteriófago M13. A phage display é moi utilizada, aínda que ten limitacións no tamaño das proteínas que pode exhibir. A bacterial display foi introducida pouco despois, en 1986, e permite a exhibición na superficie de bacterias de proteínas máis grandes. Os sistemas de bacterial display foron introducidos primeiramente por Freudl et al. e Charbit et al. en 1986, que utilizaron as proteínas da superficie bacteriana OmpA e LamB para a exhibición dos péptidos. Freudl et al. fusionaron secuencias xenéticas de péptidos con espazadores co xene ompA, o que causaba que os péptidos fosen expresados nas proteínas OmpA. Demostraron que as proteínas eran agora sometidas a clivaxe pola proteinase K. Os péptidos non OmpA inseridos eran a diana da proteinase K. A inserción dos péptidos alleos non afectou ao crecemento celular bacteriano. Charbit et al. definiron primeiramente as áreas da proteína LamB que eran "permisivas" para a inserción de péptidos alleos (é dicir, que non orixinaban unha perda completa da funcionalidade da proteína). Despois, exploraron a versatilidade dos sitios permisivos (límite de tamaño, natureza do epítopo...) que estaban todos localizados en bucles expostos na superficie da porina da membrana externa trimérica, co obxectivo de desenvolver vacinas vivas bacterianas.^[3][4] Esta foi a primeira evidencia do uso de técnicas de exhibición na superficie bacteriana para a expresión de proteínas na superficie de células, sen alterar o funcionamento da célula.^[5]

Os péptidos son moi útiles como substancias terapéuticas e diagnósticas. O seu uso cada vez é máis común, e os sistemas de display ofrecen unha vía útil para a enxeñaría de péptidos e para optimizar as súas capacidades de unión. As células expresan proteínas de superficie que poden estar implicadas nun amplo conxunto de respostas incluíndo o recoñecemento doutras células, a interacción con outras células, e a sinalización celular. Moitos tipos de bacterias teñen proteínas da superficie celular como a proteína intimina da bacteria Escherichia coli enteropatóxena, que está implicada na unión ás células hóspede, ou a proteína OmpA de E. coli, que é importante para manter a estrutura da membrana externa bacteriana.^[6] Moitas proteínas de superficie están implicadas na adhesión de células bacterianas e a invasión das células hóspede. Usando a bacterial display, poden identificarse as proteínas diana da célula hóspede. Estas proteínas de superficie necesitan primeiro ser translocadas a través das membranas da célula bacteriana desde o citoplasma á superficie celular. As bacterias gramnegativas teñen un espazo periplásmico adicional, do cal carecen as grampositivas, polo que para estas a translocación de proteínas é unha tarefa máis complicada. A exhibición de proteínas heterólogas na superficie da célula bacteriana require normalmente a fusión da proteína coa proteína superficial, que se denomina armazón.

Os armazóns utilízanse para exhibir a proteína heteróloga sobre a suerficie da célula bacteriana. Téñense utilizado varios armazóns como as proteínas da membrana externa, proteínas de fimbrias ou flaxelos e os CPX (circularly permuted OmpX, OmpX permutados circularmente).^[7] O armazón CPX permite a fusión do péptido en ambos os extremos do armazón.

Os OMPs son armazóns comúns para a bacterial display. As proteínas poden tamén ser exhibidas sobre a superficie celular bacteriana por medio do uso de autotransportadores. Os autotransportadores forman parte do sistema de secreción de tipo V. Normalmente teñen tres dominios: a secuencia líder no N-terminal; dominio pasaxeiro central; dominio autotransportador no C-terminal. A proteína heteróloga insírese no dominio pasaxeiro.^[8] Outro método de fusión de proteínas heterólogas é a fusión con fimbrias ou flaxelos, que son protrusións filamentosas da superficie da célula. As bacterias gramnegativas teñen moitas fimbrias, polo que exhibir as proteínas en fimbrias é vantaxoso comparado con outras proteínas de superficie, que son menos numerosas. Unha desvantaxe de usar fimbrias é que hai un tamaño límite de inserción relativamente pequeno de 10 a 30 aminoácidos.^[9]

Unha vez que a proteína heteróloga foi fusionada coa proteína de superficie da célula bacteriana, é exposta a un encima, a unha célula (que expresa unha proteína diana) ou a un anticorpo (xeralmente etiquetado fluorescentemente), dependendo da aplicación que teña o experimento. A mostra pásase despois por un raio de luz durante a FACS, nunha corrente de fluído moi estreita para que só unha célula poida pasar á vez, e detéctase a fluorescencia emitida. A información sobre o tamaño da célula pode obterse pola dispersión da luz e se se produciu a unión da proteína heteróloga coa proteína diana ou célula, emitirase máis fluorescencia.

A bacterial display pode utilizarse para diversas aplicacións. Entre estas están o exame baseado en afinidade, o mapado de epítopos de anticorpos, a identificación de substratos peptídicos, a identificación de péptidos que se unen a células e a xeración de vacinas.^[10]

Os exames ou screenings utilízanse para encontrar as afinidades aparentes de proteínas heterólogas exhibidas na superficie de células bacterianas para as proteínas diana. Este método adoita combinarse con FACS, e a adición dun competidor da proteína diana non fluorescente é beneficiosa para obter afinidades de unión máis axeitadas. Engadir un competidor reduce a posibilidade de que as proteínas diana se volvan a unir, o cal faría que a afinidade de unión fose menos precisa.

O mapado de epítopos de anticorpos utilízase para encontrar a especificidade dun anticorpo. O epítopo (o sitio de unión aos anticorpos dos antíxenos) exprésase na superficie de células bacterianas ao expresar unha rexión do xene que codifica o antíxeno. Utilízase a citometría de fluxo con anticorpos etiquetados fluorescentemente para detectar a cantidade de anticorpos unidos ao epítopo.^[11]

Isto pode ser aplicado para encontrar os mellores substratos para encimas proteolíticos. O substrato é exhibido na superficie da célula bacteriana entre un ligando de afinidade e o armazón, e a cinética da proteólise do substrato mídese usando FACS.

A bacterial display pode utilizarse para encontrar péptidos que se unen a células específicas, por exemplo células de cancro de mama ou células nai. As proteínas exhibidas están etiquetadas fluorescentemente con GFP, polo que as interaccións de unión entre péptidos e as células diana poden observarse por citometría de fluxo. Cómpren mostras control para medir os niveis de fluorescencia en ausencia dos péptidos exhibidos. Tamén cómpren mostras que non conteñan os péptidos exhibidos, pero que si conteñan células de mamíferos e bacterianas (incluíndo o armazón).

A entrega de vacinas é unha aplicación moi común da bacterial display. Poden fabricarse dous tipos de vacinas bacterianas vivas:

1. Bacterias normalmente patóxenas son debilitadas para que deixen de ser patóxenas.
2. Bacterias comensais ou presentes en alimentos que non son patóxenas.

O uso da bacterial display de antíxenos é unha alternativa valiosa para o deseño de vacinas convencionais por varias razóns, unha delas é que as proteínas expresadas na superficie da célula bacteriana poden actuar favorablemente como adxuvantes. As vacinas convencionais requiren a adición de adxuvantes. Outra vantaxe de xerar vacinas usando sistemas de bacterial display é que as células bacterianas completas poden ser incorporadas na vacina viva.^[12] A diferenza dos sistemas de phage display que son usados xeralmente no desenvolvemento de vacinas para encontrar epítopos descoñecidos, os sistemas de bacterial display son utilizados para expresar epítopos coñecidos e as células actúan como un sistema de entrega de vacinas.^[13]

En similares condicións, a selección de péptidos exhibidos en bacterias que se unen á proteína modelo estreptavidina demostrou ter un rendemento peor que na phage display.^[14]

• Charbit A, Sobczak E, Michel ML, Molla A, Tiollais P, Hofnung M. Presentation of two epitopes of the preS2 region of hepatitis B virus on live recombinant bacteria. J Immunol. 1987 Sep 1;139(5):1658-64.
• Charbit A, Molla A, Saurin W, Hofnung M.Versatility of a vector for expressing foreign polypeptides at the surface of gram-negative bacteria. Gene. 1988 Oct 15;70(1):181-9.