siRNA

siRNA edo ingelesez small interfering RNA (siRNA), 20-25 nukleotidoz osatutako kate bikoitzeko RNA (double strand RNA) interferente mota bat da^[1], transkripzioaren ondoren adierazpen genetikoa espezifikoki inhibitzeko gai dena^[2]. Jakina da pertsona ororen informazio genetikoa genetan antolatuta DNAn gordeta dagoela eta gene horiek adierazteko, hau da, gene-produktuak sintetizatzeko, transkripzio prozesua ematen da, horrela, mRNA (RNA mezularia) sortzen delarik, DNAtik abiatuta. Hala eta guztiz ere, azpimarratu beharra dago gene batzuen produktuak bestelako RNA mota batzuk izan daitezkela. Gauzak horrela, mRNA nukleotik zitoplasmara garraiatzen da eta bertan erribosomekin elkartuz itzulpena ematen da proteinak sintetizatzeko. Edonola ere, zenbait kasutan sintetizatu diren mRNA molekulak ez dira adierazi behar. Prozesu hori burutzen dutenak iRNAk dira, horien artean siRNA ^[3].

iRNA molekulen bidezko transkripzio ondorengo geneen isilpen mekanismoa landareetan behatu zen lehen aldiz 1990ean. Ikertzaileen helburua petuniaren loreek kolore bioleta intentsoagoa izatea zen, eta horretarako, zenbait transgene barneratu zituzten. Esperimentuaren emaitza ez zen esperotakoa izan, izan ere, gune zuriak zituzten loreak lortu zituzten; hortaz, barneratutako trangeneak nahiz gene endogenoak mekanismo ezezagun baten bidez isilduak izan zirela ondorioztatu zuten^[4]. Transgenearen gehiegizko adierazpenak kolore bioleta kodetzen duen gene endogenoaren ko-itzalpena eragin zuela ondorioztatu zuten ikertzaileek. Hala ere, ekintza mekanismoa ezezaguna zen oraindik ere.

Aurrerago, gene adierazpena Caenorhabditis elegans nematodatan hasi ziren ikertzen. 1998an, Andrew Fire eta Craig Mellok iRNA molekulen ekintza mekanismoa deskribatu zuten. 2006. urtean iRNA molekulen aurkikuntzagatik Nobel Saria irabazi zuten. Nature^[5] aldizkarian argitaraturako lan batean zizareei kate bakarreko RNA gehituta (sense edo antisense izan) horrek gene adierazpenean inolako eraginik ez zuela adierazi zuten, ordea, zizarean kate bikoitzeko RNA gehituta (dsRNA), intereseko genearen adierazpena itzaltzen zela behatu zuten.

Bestalde, geneen adierazpenaren inhibizioa gertatzeko zizareetan barneratutako dsRNA molekulak genomako zati kodetzaile baten osagarria izan behar duela zehaztu zuten, hau da, exon baten osagarria. Horren harira, interferentzia mekanismoa mRNA mailan gertatzen dela ondorioztatu zuten, pre-mRNAko intronak jada ezabatu direnean, alegia. Laburbilduz, transkripzio ondorengo mekanismo bat zela argitu zen^[5].

iRNA molekulen itua mRNA zela frogaturik, azaldu beharreko hurrengo puntua mRNA horren degradazio mekanismoa zen. Horretarako, zenbait esperimentu burutu ziren, ateratako ondorioak hurrengoak izan zirelarik: dsRNA fragmentuak 21-25 nukleotidoko zatitan mozten dira, zeinak mRNA itu bat ezagutu eta hori degradaziora bideratzeko gai diren. Azkenean, molekula horien artean siRNA deritzon molekula bat zegoela jakin zen.

siRNA molekulen ekintza mekanismoa ezaguturik, hurrengo urratsa dsRNAren zatiketan parte hartzen duen erribonukleasa (RNAasa) identifikatzea izan zen. Zenbait esperimentu burutu ondoren, dsRNA 22 nukleotido inguruko zatitan mozteko gai den entzima bakarra Dicer zela frogatu zen. Entzima hori RNAasa III familiakoa da. Bestalde, Dicer proteinak dsRNA molekuletara lotzeko beste proteina batzuekin konplexu bat eratu behar duela ikusi zen^[6].

RISC konplexua Argonauta deritzen endonukleasa familiako proteina da. Konplexu honen funtzio nagusia itu izango den mRNA molekularen harizpi osagarria duen siRNA moztea da, harizpi osagarria edo moldea konplexura lotuta geratuko delarik^[7]. Hasiera batean, siRNAren harizpien banaketa ATP (adenosin trifosfatoa) menpeko helikasa batek burutzen zuela uste zen^[8]. Gaur egun, ordea, jakina da prozesu hori ATP-arekiko guztiz independientea dela, RISC konplexuaren osagai diren zenbait proteinek burutzen baitute^[9][10]. Aurrez aipatu moduan, Argonauta familia desberdinak bereizten dira (Ago1, Ago2 eta Ago3 ugaztunetan), hala ere, mRNA itua degradatzeko gai den RISC konplexua osatu dezaketen bakarrak Ago2 familiakoak dira^[11].

dsRNA molekula Dicer deritzon entzima batekin elkartzen da. Aipatzekoa da dsRNA molekula hori transgene exogeno batetik, birus baten infekzioaren ondorioz edota elementu genetiko propio baten bidez sintetizatu daitekeela. Dicer proteinak dsRNA gutxigora behera 21-23 nukleotidoko fragmentutan zatitzen du. Zati horiei siRNA deritze eta osagai desberdinez osatutako konplexu batera lotzen dira, RISC konplexura. siRNA-rik ez badago, RISC konplexuak ez du ezpezifikotasunik mRNA itu molekuletara lotzeko. Hala eta guztiz ere, siRNA harizpi gidarira lotzean, RISC konplexua, zeina orain jada aktibatuta dagoen, mRNA ituaren degradazio espezifikoa burutzeko gai da, genaren isilpena bultzatzen delarik. Aipatzekoa da kasu gehienetan adierazpen-inhibizioa ez dela totala, hau da, adierazpena gutxitu egiten da, eta fenomeno horri knock-down edo isilerazpen partziala deritzo.

RISC konplexuak siRNAren bi harizpiak banatzen ditu, izan ere, aktibatua izan dadin harizpi bakarra eduki behar du lotuta, harizpi moldea zehazki. RISC konplexuak harizpi molde hori bere substratua hautatzeko erabiliko du: harizpi horren sekuentzia osagarria duen mRNA. Jarraian, RISC konplexuak mRNA molekularen mozketa eta degradazioa burutuko ditu, eta ondorioz, gene adierazpena inhibitzen da.

iRNAren ibilbidea biologia molekularrean eta zelularrean erabiltzen da geneek zelula-hazkuntzetan eta in vivo organismo eredugarrietan duten funtzioa aztertzeko^[12]. Horretarako, dsRNA (edo siRNAs/shRNAs ugaztunetan) sintetizatzen da, intereseko genearen sekuentzia osagarri batekin, eta zelula edo organismo batean sartzen da, non material genetiko arrotz gisa ezagutzen den, eta ondorioz, iRNAren ibilbidea aktibatzen da. Mekanismo hori erabiliz, ikertzaileek itu-genearen adierazpena nabarmen murriztu dezakete. Murrizketa horren ondorioak aztertuta, gene horren produktuaren funtzio fisiologikoak argitu daitezke^[13]. Horrez gain, aipatzekoa da siRNAak nukleotido bakarreko diferentzia duten sekuentziak bereizteko gai direla. Ezberdintasun bakar bat bereizteko gaitasuna duten siRNA-mota horiei alelo-espezifiko siRNA deritze^[14].

Proposatutako erabilera kliniko batzuk terapia antibiraletan oinarritzen dira, besteak beste, minbizi-zeluletako adierazpen geniko biralaren inhibizioa, GIBaren hartzaileak^[15] eta zuzentzaileak ostalarian isilaraztea, A hepatitisaren^[16] birusaren eta B hepatitisaren^[17] isiltzea, gripearen birusaren adierazpenaren isiltzea^[18] eta elgorriaren birusaren erreplikazioaren inhibizioa.^[19]

Gaixotasun neurodegeneratiboetarako tratamendu potentzialak ere proposatu dira, poliglutaminetako gaixotasunei arreta berezia eskainiz, hala nola, Huntingtonen^[20] gaixotasunari. RNAren interferentzia minbizia tratatzeko aukera probartzat ere hartzen da, tumore-zeluletan gehiegi adierazitako geneak edo zelulen banaketan (mitosian) inplikatutako geneak isilaraziz^[21][22].

siRNAk erraz sintetizatzen eta erabiltzen dira. Desabantailetako bat burutzen duten  isilarazpenaren iraupen laburra da, eta gainera, ez da erraza transfektatzen zailak diren zeluletan sartzea, kultibo primarioetan esaterako.

siRNA hautapenerako lehen urratsa interes-genearen mRNA sekuentziarekin hasten da eta, gauzak horrela, siRNAren diseinurako programa informatiko egokia hautatzen da. Gutxienez lau mota desberdinetako siRNAen isilarazpen-maila diseinatzea eta probatzea gomendatzen da, ez baitago %100eko bermerik siRNA eraginkor eta espezifikoen diseinuan. Behin diseinua prest dagoela, hautatutako siRNAren sintesi kimikoa hainbat konpainiari ordenatu dakieke. Azkenik, siRNAk zeluletara zuzenean sar daitezke transfekzio deritzon prozesu baten bitartez.

Sintetikoki ekoitzitako siRNA hauek toxinen maila baxuak sortzen dituzten elikadura-landareen diseinuan erabili ohi izan dira. Esaterako, kotoi-haziak proteina nutritiboetan aberatsak dira, baina gosipol produktu terpenoide toxikoa modu naturalean dute, eta, beraz, ez da egokia gizakiak kontsumitzeko^[23]. Hortaz, iRNA erabili da delta-kadineno sintetasaren, gosipolaren sintesian parte hartzen duen entzimaren, maila txikiak dituzten hazien kotoizko anduiak ekoizteko, landarearen beste zati batzuetan gosipolaren ekoizpenari eragin gabe.