Hasle

Hasleak harizpi bakarreko azido nukleiko kate laburrak dira, organismo bizidun guztiek erabiltzen dituztenak DNAren sintesia hasteko. DNA polimerasa entzima (DNAren erreplikazioa burutzen duena) nukleotidoak gehitzeko gai da soilik 3’ mutur aske batera, eta beraz, erreplikatu nahi den DNA kateari hasle bat lotuta egotea beharrezkoa da entzima honek erreplikazioa burutu ahal izateko.^[1] DNA polimerasak nukleotidoak gehitzen ditu RNA hasleari lotu ostean eta DNA kate osoa sintetizatzen du. Ondoren, RNA zati hauek kendu behar dira eta DNArekin ordeztu, eta prozesu horretan “nick” izeneko koska bat geratzen da, ligasa izeneko entzima batek konpontzen duena, hau da, hutsunea kentzen da bi zatiak lotuz.^[2] RNA hasleen ezabaketan hainbat entzimek hartzen dute parte; hala nola, Fen1, Lig1, etab., DNA polimerasarekin era koordinatuan lan egiten dutenak RNA nukleotidoen ezabaketa eta DNA nukleotidoen gehiketa modu egokian egiten dela ziurtatuz. Organismo bizidunek soilik RNAzko hasleak erabiltzen dituzte, baina biokimikako eta biologia molekularreko laborategiko tekniketan, non DNAren sintesia in vitro burutu behar den (DNA sekuentziazioan edo PCRan, adibidez), askotan DNAzko hasleak erabiltzen dira, tenperaturarekiko egonkorragoak diren aldetik. Hasleak laborategian diseinatu daitezke erreakzio espezifikoetarako, PCRrako (Polymerase Chain Reaction) adibidez. PCRrako hasleak diseinatzerakoan, hainbat ezaugarri hartu behar dira kontuan; hala nola, haslearen fusio tenperatura eta hibridazio tenperatura. Halaber, haslea itsatsiko den DNAren sekuentzia espezifikoki aukeratu behar da, eta horretarako BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) herramienta erabiltzen da, zeinak DNA eskaneatzen duen eta haslea lotzeko toki espezifikoak hautatzen dituen.

in vivo RNA hasleak

Organismo bizidunek RNA hasleak erabiltzen dituzte DNA kate baten sintesia hasteko. Primasa izeneko entzimek DNArekiko osagarriak diren RNAzko hasleak gehitzen dituzte de novo aurreranzko eta atzerantzko urkiletan. Haslearen 3’-OH asketik abiatuta, DNA polimerasa batek DNA kate osoa sintetizatu dezake. DNA erreplikazioan, aurrerazko urkila modu jarraituan sintetizatzen da, erreplikazio urkilaren norazko berean, soilik hasierako RNA haslea behar duelarik. Aldiz, atzerantzko urkilean, moldeak 5 ’→3’noranzkoa dauka, baina DNA polimerasak ezin ditu 3’→5’ noranzkoan nukleotidoak gehitu, eta beraz, DNA ‘atzerantz’ sintetizatzen da, zatika, erreplikazio urkiletik urruntzen diren fragmentu laburretan. Fragmentu hauei Okazaki zatiak deritze. Atzerazko urkilean DNAren sintesia zatika egiten denez, hainbat RNA hasle behar dira, bat zati bakoitzeko. Hortaz, DNA katean zehar primasek hainbat RNA hasle sakabanatzen dituzte, ondoren, DNA polimerasak erabiliko dituenak DNA 5’→3’ noranzkoan sintetizatzeko.^[1]

DNAren sintesia burutu ahal izateko RNA hasleen beharraren beste adibide bat alderantzizko transkripzioa da. Alderantzizko transkriptasa RNA harizpi bat moldetzat erabilita DNA harizpi osagarri bat sintetizatzen duen entzima da. Kasu hoentan ere, DNA polimerasak 3’ mutur aske bat egotea behar du sintesia hasi ahal izateko, eta beraz, hasleak ere erabili behar dira.^[1]

Hasleen ezabaketa

Okazaki zatiak sintetizatu direnean, RNA hasleak ezabatzen dira (mekanismoa ezberdina da eukariotoetan eta prokariotoetan) eta DNA nukleotidoekin ordezkatzen dira, hutsuneak betez. Ondoren, DNA ligasak zatiak lotzen ditu, harizpi berriaren sintesiari amaiera emanez.^[1]

Prokariotoetan, DNA polimerasa I entzimak sintetizatzen ditu Okazaki zatiak, aurreko RNA haslera heltzen den arte. Ondoren, entzima berak 5’→3’ exonukleasa aktibitatea burutzen du, RNA haslearen nukleotidoak ezabatuz eta desoxirribonukleotidoak gehituz, eta okazaki zatiaren eta ordeztutako haslearen artean lotura aske bat utziz. Lotura aske hauek DNA ligasek lotzen dituzte.

Hasle eukariotikoak ezabatzeko, δ DNA polimerasak Okazaki zatiak sintetizatzen ditu, 5’→3’ norabidean, eta aurreko Okazaki zatiko RNA haslearekin topo egitean, haslearen 5’ muturra ezabatzen du bere nukleasa aktibitateagatik.^[3]

Hasle sintetikoen erabilerak

Hasle sintetikoak kimikoki sintetizatutako oligonukleotidoak dira, normalean DNAzkoak, espezifikoki diseinatu daitezkeenak DNA kate baten toki espezifiko batean lotzeko. Soluzioan, hasleak espezifikoki hibridatzen dira DNA katearekin, Watson-Crick osagarritasun ereduari jarraituz. Hasle sintetikoak sortzeko eta gure beharren arabera diseinatzeko ahalmena ezinbesteko herramienta bat da biologia molekularrean. Esaterako, DNAren sekuentziaziorako, Sanger-en metodoan eta Next-Gen metodoan hasleak behar dira erreakzioa hasi ahal izateko.^[1]

PCRrako hasleen diseinua: Hasleak izan behar dituzten ezaugarriak

PCRak (Polymerase Chain Reaction) hasle espezifiko pare bat erabiltzen du, bakoitza anplifikatu nahi den sekuentziaren mutur batean kokatuz, mutur bakoitzetik DNAren elongazioa burutzeko. Hasle hauek normalean 18 eta 24 nukleotidoko luzeera daukate eta soilik anplifikatu nahi den sekuentziaren aurretik eta atzetik dauden leku espezifikoetan hibridatu daitezke. Izan ere, DNAren leku ezberdinetan hibridatu daitekeen hasle bat erabiltzen bada, intereseko sekuentzia anpilfikatu beharrean, zati ezberdinak anplifikatuko dira, eta beraz, ez da PCRaren helburua beteko.^[1]

Hasle bikote bat diseinatzerakoan, hainbat kriterio hartu behar dira kontuan. Hasteko, biek antzeko fusio tenperatura izan behar dute, izan ere, erreakzioan hibridazioa aldi berean gertatzen da bi harizpietan, tenperatura berdinean, eta horretaz gain, fusio tenperatura hau ezin da hibridazio tenperatura baino askoz altuagoa edo baxuagoa izan. Ta (hibridazio tenperatura) baino Tm (fusio tenperatura) askoz altuagoa duen hasle bat gaizki hibridatu daiteke eta interesekoa ez den beste zati bat anplifikatu dezake. Aldiz, Ta baino askoz Tm baxuagoa duen hasle bat ezingo da hibridatu eta ez da anplifikaziorik gertatuko.

Horretaz gain, hasleak espezifikoki diseinatu behar dira DNA zati jakin batean hibridatzeko, DNA katearen beste tokiren batean hibridatzea ekidituz. Horretarako asko erabiltzen den herramienta bat BLAST bilaketa da, eta honen bidez, DNA kate batean hasle jakin bat non hibridatu daitekeen jakingo dugu. BLAST bilaketaren bidez, hasleak zein DNA sekuentziak bilatu daitezke. Dohainiko NCBIren Primer-BLAST herramientak hasleen diseinua eta BLAST bilaketa aplikazio bakarrean integratzen ditu^[4]. Antzeko funtzioa daukate softwaren produktu komertzial askok, hala nola, ePrime edo Beacon Designer. Ordenagailu bidezko PCRen emaitza teorikoen simulazioak (PCR elektronikoak) egin daitezke hasleen diseinuan laguntzeko, hibridazio eta fusio tenperaturak emanez, etab.

Haslea hibridatuko den DNAren tokia aukeratzerakoan ere, zenbait gauza izan behar dira kontuan. Esaterako, mononukleotido eta dinukleotidoetan errepikapen asko dituzten sekuentziak ez dira egokiak, izan ere, hasleak bigarren mailako egiturak eratu ditzake edota gaizki hibridatu daiteke. Hasleek ez lukete beste hasleekin hibridatu behar; fenomeno honek hasleen dimeroak eratzea eragin dezake, produktu hauek PCRaren emaitza kontaminatuko dutelarik.

Hasleak diseinatzerakoan, nukleotido extrak gehitu daitezke haslearen muturretan, "cap" sekuentziak eratuz anplifikatutako sekuentzietan. Honen erabilera bat TA klonazioa da, PCRaren antzeko subklonazio teknika espezifiko bat, non efizientzia hobetu daitekeen AG isatsak gehituz 5’ eta 3’ muturretara.^[5]

Hasle endekatuak

Kasu batzuetan, hasle endekatuak erabili behar dira. Hauek antzekoak, baina ez identikoak diren hasleen nahasketak dira. Komenigarriak izan daitezke organismo ezberdinen gene berdina anplifikatzeko, izan ere, sekuentziak antzekoak izango dira, baina ez identikoak. Hau erabilgarria da kode genetikoa bera endekatua delako, hau da, kodon ezberdinek aminoazido berdina kodetu dezakete. Honek organismo ezberdinek sekuentzia genetiko desberdina izanda antzeko proteinak kodetzea ahalbidetzen du. Horregatik, hasle endekatuak erabiltzen dira hasleen diseinua proteinen sekuentzian oinarrituta egiten denean, ez delako nukleotidoen sekuentzia zehatza ezagutzen. Adibidez, isoleuzina aminoazidoari dagokion haslearen sekuentzia “ATH” izan daiteke, non A adeninari dagokion, T timinari eta H adenina, timina edo zitosinari, kodon bakoitzari dagokion kode genetikoaren arabera, base endekatuentzako IUPAC sinboloak erabiliz. Hasle endekatuek ez dute zertan modu perfektuan hibridatu itu sekuentziarekin, eta honek asko murrizten du PCRaren anplifikazioaren espezifitatea.

Hasle endekatuak oso erabilgarriak dira eta asko erabiltzen dira ekologia mikrobialean. Oso gutxi kultibatutako mikroorganismoen geneen anplifikazioa edota haien genoma erabilgarri ez dagoen mikroorganismoen geneen berreskurapena ahalbidetzen dute. Normalean, hasle endekatuak GenBank-en aurkitutako sekuentziekin alderatuz diseinatzen dira. Sekuentzien arteko endekapenak IUPACen nukleotido indibidualen endekapenerako arauei jarraituta betetzen dira. PCR hasleak kodonen sekuentziaren permutazio guztiei dagokien hasle nahasketa bat osatuz sintetizatzen dira.

Erreferentziak

↑ ^a ^b ^c ^d ^e ^f Cox, Michael M.. (2015). Molecular biology : principles and practice. (Second edition. argitaraldia), 221–238, 369–376, 592–593 or. ISBN 978-1-4641-2614-7. PMC 905380069. (Noiz kontsultatua: 2022-03-22).
↑ Henneke, Ghislaine. (2012-10-15). «In vitro reconstitution of RNA primer removal in Archaea reveals the existence of two pathways» The Biochemical Journal 447 (2): 271–280. doi:10.1042/BJ20120959. ISSN 1470-8728. PMID 22849643. (Noiz kontsultatua: 2022-03-22).
↑ A., Rossi, Marie Louise Bambara, Robert. (2011-02-23). Distinguishing the pathways of primer removal during Eukaryotic Okazaki fragment maturation. PMC 891546881. (Noiz kontsultatua: 2022-03-22).
↑ «Primer designing tool» www.ncbi.nlm.nih.gov (Noiz kontsultatua: 2022-03-22).
↑ Peng, Ri-He; Xiong, Ai-Sheng; Liu, Jin-ge; Xu, Fang; Bin, Cai; Zhu, Hong; Yao, Quan-Hong. (2007-04). «Adenosine added on the primer 5′ end improved TA cloning efficiency of polymerase chain reaction products» Analytical Biochemistry 363 (1): 163–165. doi:10.1016/j.ab.2007.01.014. ISSN 0003-2697. (Noiz kontsultatua: 2022-03-22).

Kanpo estekak

Datuak: Q334828
Multimedia: DNA replication / Q334828

[:0-1] ↑ ^a ^b ^c ^d ^e ^f Cox, Michael M.. (2015). Molecular biology : principles and practice. (Second edition. argitaraldia), 221–238, 369–376, 592–593 or. ISBN 978-1-4641-2614-7. PMC 905380069. (Noiz kontsultatua: 2022-03-22).

[2] Henneke, Ghislaine. (2012-10-15). «In vitro reconstitution of RNA primer removal in Archaea reveals the existence of two pathways» The Biochemical Journal 447 (2): 271–280. doi:10.1042/BJ20120959. ISSN 1470-8728. PMID 22849643. (Noiz kontsultatua: 2022-03-22).

[3] A., Rossi, Marie Louise Bambara, Robert. (2011-02-23). Distinguishing the pathways of primer removal during Eukaryotic Okazaki fragment maturation. PMC 891546881. (Noiz kontsultatua: 2022-03-22).

[4] «Primer designing tool» www.ncbi.nlm.nih.gov (Noiz kontsultatua: 2022-03-22).

[5] Peng, Ri-He; Xiong, Ai-Sheng; Liu, Jin-ge; Xu, Fang; Bin, Cai; Zhu, Hong; Yao, Quan-Hong. (2007-04). «Adenosine added on the primer 5′ end improved TA cloning efficiency of polymerase chain reaction products» Analytical Biochemistry 363 (1): 163–165. doi:10.1016/j.ab.2007.01.014. ISSN 0003-2697. (Noiz kontsultatua: 2022-03-22).

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]