Benutzer:Dietzel65/Baustelle

Dieser Artikel ist im Entstehen und noch nicht Bestandteil der freien Enzyklopädie Wikipedia.

Solltest du über eine Suchmaschine darauf gestoßen sein, bedenke, dass der Text noch unvollständig sein und Fehler oder ungeprüfte Aussagen enthalten kann. Wenn du Fragen zum Thema hast, nimm Kontakt mit dem Autor Dietzel65 auf.

Interferenzreflexionsmikroskopie

Interferenzreflexionsmikroskopie (auch: Reflexionskontrastmikroskopie) ist eine lichtmikroskopische Methode, um die Dicke von sehr dünnen Strukturen zu bestimmen. Sie beruht auf der Bildung von Interferenzen, die entstehen, weil Licht an der oberen und unteren Grenzfläche der Struktur gebrochen wird und gebrochenes Licht von beiden Grenzflächen miteinander interferiert. Dadurch entstehen Interferenz-Muster, die beobachtet werden können, und die Aufschluss über die Dicke der Struktur liefern. ^[1][2] Ähnlich wie bei der Internen-Totalreflektions-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF) ist die Beobachtung auf Objekte in der Nähe des Deckglases beschränkt, dafür werden Informationen über Strukturen gewonnen, die größenordnungsmäßig unter der Auflösungsgrenze des Lichtmikroskops liegen.

Das Verfahren hat von verschiedenen Autoren unterschiedliche Namen erhalten. Die älteste Bezeichung (1964) ist Interference Reflection Microscopy (IRM), auf deutsch Interferenzreflexionsmikroskopie. Weitere Bezeichnungen sind Reflection Contrast Microscopy (RCM; 1975), auf deutsch Reflexionskontrastmikroskopie und Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM, 1981).^[2][3] Eine englische Übersichtsarbeit aus dem Jahr 2000 listet außerdem: interference contrast, interference reflection contrast, reflection interference contrast, surface reflection interference und surface contrast microscopy.^[4]

Die Technik wurde erstmals 1958 beziehungsweise 1960 für die Untersuchung von Dünnen Schichten eingesetzt und 1964 in der Zellbiologie eingeführt. Jedoch erst etwa zehn Jahre später wurden weitere Arbeiten publiziert. In den 1970er wurde die Technik weiterentwickelt und von Ernst Leitz sowie Carl Zeiss kommerziell angeboten.^[1][4][2] Das Verfahren hat sich nicht breit durchsetzen können, für spezielle Anwendungen kam es in den 1970er und 1980er Jahren zu einer Häufung von Veröffentlichungen.^[4]

Eingesetzt wurde das Verfahren besonders häufig für die Untersuchung von Zelladhäsion an Glas und die Bestimmung der Dicke von Zellausläufern (Pseudopodien)^[1]. Fokale Adhäsionspunkte wurden 1976 erstmals mit dieser Technik beschrieben^[2]. Andere Anwendungen waren die Untersuchung von Retikulozyten in Blutaustrichen, da diese sich bei der Reflexionskontrastmikroskopie gut von roten Blutkörperchen (Erythrozyten) unterscheiden lassen^[5], sowie Untersuchungen von Chromosomenpräparaten und des Cytoskeletts in fixierten Zellen.^[2]

Interferenzreflexionsmikroskopie beruht auf den Prinzipien Auflicht, Reflexion und Interferenz. Die Realisierung erfolgt mit Auflichtbeleuchtung bei Ölimmersion mit reflexionsarmen Objektiven und einer Zentralblende im Beleuchtungsstrahlengang, so dass den Kontrast vermindernde Reflexionen an den Glasoberflächen minimiert werden. ^[1]

Bei Auflicht wird das Bild eines transparenten Objekts durch Reflexion des Lichts an Grenzflächen verursacht, an denen sich der Brechungsindex ändert. Die Intensität des zurückgeworfenen Lichts ist dabei um so stärker desto stärker der Brechungsindex-Unterschied ist. Immersionsöl und Glas haben einen sehr ähnlichen Brechungsindex. Bei einem Präparat mit lebenden Zellen, die unter einem Deckglas wachsen und mit Ölimmersion im Auflicht beobachtet werden, tritt daher der erste Brechungsindexunterschied am Übergang vom Deckglas zum wässrigen Medium auf, in dem sich die Zellen befinden. Hierbei entsteht eine vergleichsweise starke Reflexion. Befindet sich jedoch eine Zelle an der Stelle, dann ist der Brechungsindex-Unterschied, hier zwischen Deckglas und Zelle bzw. Zellmembran, deutlich geringer, die Reflexion entsprechend schwächer.^[2]

Befindet sich zwischen der Zelle und dem Deckglas noch ein mit Medium gefüllter Zwischenraum, so kann dessen Dicke mit Hilfe der Interferenzreflexionsmikroskopie untersucht werden: Reflexion findet zuerst am Übergang Deckglas - Medium und dann am Übergang Medium-Zelle statt. Wenn der Abstand zwischen diesen beiden Übergängen in der Größenordnung der Wellenlänge des verwendeten Lichts liegt, so können die beiden reflektierten Strahlen miteinander interferieren. Bei der Verwendung von monochromatischem Licht, dass nur eine oder wenige Wellenlängen enthält, entstehen daher helle und dunkle Bereiche. Bei weißem Licht entstehen dagegen bunte Bereiche, je nachdem welche Wellenlängen negativ oder positiv interferieren. Aus diesen Beobachtungen lassen sich daher Informationen über den Abstand von Zelle zum Deckglas ablesen, und zwar in Größenordnungen, die deutlich unter der Auflösung eines Lichtmikroskops liegen.

Der beschriebene Effekt kann jedoch erheblich gestört werden durch reflektierte Strahlen, die an anderen Grenzflächen entstehen, beispielsweise flachen Zellfortsätzen vom Übergang der hinteren Zellmembran in das umgebende Medium. Dieses Problem kann vermindert werden, wenn die Beleuchtung mit hoher Numerischer Apertur erfolgt und die Zelle mindestens einen Mikrometer dick ist, da die obere Zellmembran dann aufgrund der optischen Gegebenheiten nicht mehr zum Interferenzbild beitragen kann. Unter Berücksichtigung der Zelldicke lassen sich dann quantitative Untersuchungen durchführen. Häufiger wurden jedoch quantitative Untersuchungen durchgeführt, beispielsweise zur Anzahl Fokaler Adhäsionspunkte. ^[2]

Durch den Einsatz von Polarisationsfiltern im Strahlengang und einem λ/4-Plättchen im Objektiv (Antiflex-Objektiv), wird Licht, das an Glasoberflächen innerhalb des Objektivs selbst reflektiert wird, herausgefiltert. Aus praktischen Gründen wird die Beobachtung von Zellen meist auf einem inversen Mikroskop durchgeführt, so dass sich die Zellen zwar im Strahlengang hinter dem Deckglas, tatsächlich aber auf ihm befinden. Am gleichen Mikroskop lässt sich auch Zubehör für andere Spezialverfahren anbringen, wie beispielsweise Fluoreszenzmikroskopie oder Differentialinterferenzkontrast, so dass sich diese Techniken kombinieren lassen.^[2]

• „Dreidimensionale Zytometrie und Rekonstruktion des Reliefs roter Blutzellen im Reflexionskontrast“ mit Abbildungen, prof-piper.com.
• Das Prinzip der verwandten Technik "Confocal Reflection Microscopy", Reflexionsmikroskopie mit dem Konfokalmikroskop (auf englisch) [1]

1. ↑ ^{a b c d} Patzelt WJ: Reflexionskontrast, ein neues mikroskopisches Verfahren. In: Naturwissenschaften. 63. Jahrgang, Nr. 11, November 1976, S. 535, doi:10.1007/BF00596860, PMID 1004619 (springerlink.com). 
2. ↑ ^{a b c d e f g h} Verschueren H: Interference reflection microscopy in cell biology: methodology and applications. In: J. Cell. Sci. 75. Jahrgang, April 1985, S. 279–301, PMID 3900106 (biologists.org). 
3. ↑ Parthasarathy R, Groves JT: Optical techniques for imaging membrane topography. In: Cell Biochem. Biophys. 41. Jahrgang, Nr. 3, 2004, S. 391–414, doi:10.1385/CBB:41:3:391, PMID 15509889. 
4. ↑ ^{a b c} Filler TJ, Peuker ET: Reflection contrast microscopy (RCM): a forgotten technique? In: J. Pathol. 190. Jahrgang, Nr. 5, April 2000, S. 635–8, doi:10.1002/(SICI)1096-9896(200004)190:5<635::AID-PATH571>3.0.CO;2-E, PMID 10727991 (wiley.com). 
5. ↑ Pera F: Nachweis von Reticulocyten und plastische Darstellung der Blutzellen mittels Reflexionskontrast. In: Journal of Molecular Medicine. 58. Jahrgang, Nr. 22, November 1980, S. 1261–1266, doi:10.1007/BF01478933 (springerlink.com).