CTLA-4

 

CTLA-4 został zidentyfikowany w bibliotece cDNA mysich limfocytów T cytotoksycznych w 1987 roku. Na podstawie analizy sekwencji nukleotydowych oraz przewidywanej sekwencji aminokwasowej odkrywcy zaklasyfikowali CTLA-4 do białek nadrodziny immunoglobulin^[5]. Ludzki gen CTLA-4 zawiera 4 egzony^[2]. Wykazano silne podobieństwo sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej CTLA-4 do CD28, innego białka szeroko występującego na limfocytach T. Zarówno u myszy, jak i u człowieka obydwa geny znajdują się na tym samym chromosomie i w bezpośrednim sąsiedztwie, co wskazuje na pochodzenie od jednego genu, który uległ duplikacji^[6]. Zgodnie z wnioskami wynikającymi z analizy sekwencji, model struktury mysiego CTLA-4 opublikowany na bazie badań krystalograficznych w 2000 roku wskazuje, że białko to należy do nadrodziny immunoglobulin i posiada topologię części zmiennej^[1].

CTLA-4 występuje w formie homodimeru, przy czym podjednostki są połączone mostkiem siarczkowym między cysteinami 120 obydwu łańcuchów. Forma monomeryczna ma zdolność do wiązania ligandów, ale nie powoduje uaktywnienia szlaków sygnałowych^[7][1]. Nietypową cechą dimeru CTLA-4, rzadko spotykaną w innych polimerycznych białkach, jest fakt, że miejsca wiązania ligandów znajdują się nie na styku dwóch podjednostek, formujących wspólnie pojedyncze miejsce wiążące, ale w znacznym oddaleniu od siebie. Pozwala to na wiązanie dwóch ligandów przez jeden dimer CTLA-4, a w konsekwencji na tworzenie w błonie komórkowej polimerycznych struktur CTLA-4 na przemian z CD80/CD86 w sposób przypominający zamek błyskawiczny^[8][3][4]. Monomer błonowej formy CTLA-4 (CTLA-4TM) składa się ze 130 reszt aminokwasowych^[9]. Masa cząsteczkowa w pełni glikozylowanego dimeru wynosi 45 kDa^[10].

Poza pełną formą błonową opisano również formę rozpuszczalną (w skrócie sCTLA-4, z ang. soluble lub CTLA-4delTM^[11]). W wyniku alternatywnego splicingu pierwotnego transkryptu może dochodzić do utraty egzonu 3, który koduje fragment transbłonowy. W ten sposób powstaje białko wydzielane do otoczenia, zawierające pełną domenę zewnątrzkomórkową^[10]. Forma rozpuszczalna ludzkiego CTLA-4 składa się ze 137 reszt aminokwasowych i przy pełnej glikozylacji ma masę cząsteczkową 23 kDa^[11][10]. Oprócz tego, że w trakcie splicingu sCTLA-4 usuwany jest jeden z egzonów, dochodzi jednocześnie do przesunięcia ramki doczytu, co powoduje dodanie kolejnych 22 kodonów przed kodonem stop. W wyniku tego forma rozpuszczalna jest dłuższa od formy błonowej, mimo braku fragmentu transbłonowego^[10].

Trzecią opisaną izoformą CTLA-4 jest forma o nazwie liCTLA-4 (ang. ligand-independent CTLA-4), która jest niezdolna do wiązania CD80/CD86. Powstaje ona również w rezultacie alternatywnego splicingu i utraty egzonu 2. Egzon ten koduje domenę zewnątrzkomórkową, a zatem również fragment zawierający motyw MYPPPY, odpowiedzialny za rozpoznawanie ligandów. Taka cząsteczka wciąż jednak zachowuje funkcję inhibitora aktywacji limfocytów^[12][13]. Peptyd ten zbudowany jest z 71 reszt aminokwasowych, a jego masa cząsteczkowa jest szacowana na ok. 8 kDa^[12].

Typowa forma CTLA-4, zdolna do wiązania ligandów, nie występuje na dziewiczych limfocytach T, pojawia się natomiast po pobudzeniu limfocytu przez antygen^[5] w obecności sygnału kostymulującego biegnącego od cząsteczki CD28. Z tego względu do ekspresji CTLA-4 dochodzi w limfocytach wykazujących obecność CD28^[14]. Powierzchniowa forma CTLA-4 w warunkach homeostazy nie występuje na limfocytach B, może się jednak pojawiać w wyniku aktywacji tych komórek przez produkty bakteryjne i cytokiny^[8] lub w wyniku kontaktu z aktywowanymi limfocytami T^[15]. Rozpuszczalna forma CTLA-4 jest produkowana zarówno przez limfocyty T, jak i limfocyty B^[11]. Poza limfocytami CTLA-4 może występować również na komórkach dendrytycznych^[16][17].

CTLA-4 działa przede wszystkim jako cząsteczka hamująca aktywację limfocytów T^[18], stanowiąc tym samym element negatywnego sprzężenia zwrotnego odpowiedzi odpornościowej. Z jednej strony ekspresja CTLA-4 jest pobudzana w wyniku stymulacji kompleksu TCR/CD3^[14][19], z drugiej natomiast akumulacja cząsteczek CTLA-4 w obrębie synapsy immunologicznej jest wprost proporcjonalna do siły sygnału TCR^[20]. Funkcja CTLA-4 uwidacznia się także w przypadku indukcji tolerancji pokarmowej, gdyż blokowanie CTLA-4 nie pozwala na jej uzyskanie^[21]. Hamujące znaczenie CTLA-4, szczególnie w przypadku sygnałów indukowanych przez CD28, widoczne jest u myszy posiadających uszkodzony, niefunkcjonalny gen CTLA-4: zwierzęta te giną w 2–3 tygodniu życia na skutek niekontrolowanego podziału limfocytów (syndrom limfoproliferacyjny), co prowadzi do masywnego zapalenia w większości narządów^[22][23]. CTLA-4 występujący na limfocytach B hamuje przełączanie klas i produkcję przeciwciał^[8][24].

 

Molekularne mechanizmy inhibitorowego działania CTLA-4 opierają się na następujących zjawiskach:

• Współzawodnictwo o ligandy z CD28. W tym wypadku istotną rolę odgrywa fakt, że zarówno CTLA-4 jak i CD28 wiążą te same cząsteczki^[3][4], jednak powinowactwo CD28 do CD80 i CD86 jest mniejsze, niż powinowactwo CTLA-4. Prowadzi to do wyłączania CD28 z kompleksów z ligandami, a tym samym obniża poziom sygnału aktywującego limfocyty, a mechanizm ten odgrywa istotną rolę zarówno w przypadku formy błonowej CTLA-4, jak i formy rozpuszczalnej^[25][26].

• Hamowanie sygnału biegnącego od kompleksu TCR/CD3. Wewnątrzkomórkowy fragment CTLA-4 zawiera motyw aminokwasowy YVKM zdolny do wiązania fosfatazy SHP2^[27], chociaż prawdopodobnie wiązanie tego enzymu zachodzi nie bezpośrednio, ale za pośrednictwem innej kinazy, PI3K^[28]. SHP-2 odpowiada m.in. za hamowanie fosfolipazy C gamma uruchamianej przez CD3. Rekrutacja kinazy SHP2 nie jest jednak niezbędna do hamującego działania CTLA-4^[29][30]. Ponadto sygnał od TCR może być hamowany przez inną fosfatazę, PP2A, również wiążącą się z CTLA-4^[31].

• Hamowanie sygnału kostymulującego CD28. Fosfataza PP2A ma zdolność do hamowania produkcji IL-2 stymulowanej przez CD28^[32] poprzez blokowanie kinazy Akt^[33].

• Modyfikacja szlaków kinaz MAP uruchamianych przez TCR, np. wzmocnienie szlaku JNK przy jednoczesnym hamowaniu szlaku ERK^[34].

• Hamowanie cyklu komórkowego. Sygnał biegnący od CTLA-4 powoduje, że w limfocytach T dochodzi do zmian ekspresji białek odpowiedzialnych za kontrolę cyklu komórkowego i w konsekwencji do spowolnionego przechodzenia komórek z fazy G1 do fazy S^[35].

• W limfocytach B ligacja CTLA-4 powoduje blokowanie szlaków NF-kB oraz STAT^[8].

• W komórkach dendrytycznych wiązanie CTLA-4 prowadzi do ekspresji oksydazy 2,3-indolowej oraz interleukiny 10, które wpływają supresyjnie na limfocyty^[17]

CTLA-4 jako białko hamujące odpowiedź odpornościową może odgrywać dwojaką rolę w procesach chorobowych:

• zwiększona ekspresja może prowadzić do immunosupresji
• jego niedobór lub dysfunkcja prowadzi do utraty kontroli nad limfocytami i rozwoju chorób o podłożu zapalnym.

Rozwój nowotworów jest zwykle powiązany z wyciszeniem funkcji odpornościowych^[36][37]. Zgodnie z tymi obserwacjami opisano asocjację pomiędzy wysoką ekspresją CTLA-4 na leukocytach a chorobami nowotworowymi, np. rakiem krtani^[38], mięsakiem Ewinga^[39], rakiem wątrobowokomórkowym^[40][17], rakiem prostaty^[41] i rakiem płuc^[42]. Szczególnie istotna jest ekspresja CTLA-4 na limfocytach Treg^{[40][38][43][44]} oraz lifocytach CD8+^[41]. Polimorfizm genu CTLA4 wydaje się być związany z podatnością na rozwój niektórych chorób nowotworowych – posiadanie niektórych odmian tego genu może być czynnikami ryzyka w przypadku np. raka jamy ustnej^[45], raka szyjki macicy^[46] czy raka płuc^[47].

Słabsza ekspresja CTLA-4 na powierzchni limfocytów T została zaobserwowana w przypadku niektórych chorób o podłożu autoimmunologicznym, np. stwardnieniu rozsianym^[48]. Zmniejszona ekspresja niezależnej od liganda formy CTLA-4 jest skorelowana ze zwiększoną zapadalnością na cukrzycę typu I^[49][50], ale rola tej formy białka nie jest dobrze poznana. Asocjację występowania określonych alleli genu CTLA4 z chorobami autoimmunizacyjnymi wskazano m.in. w przypadku cukrzycy typu I^[51][52], tocznia układowego rumieniowatego^[53], choroby Gravesa^[54], stwardnienia rozsianego^[55], autoimmunologicznym zapaleniem trzustki^[56] i innymi^[57][58].

Polimorfizm CD152 jest związany z ryzykiem odrzucenia przeszczepu^[59]. Limfocyty T CD4+ w wyniku infekcji HIV zwiększają ekspresję CTLA-4, co może mieć wpływ na rozwój niedoboru odporności u pacjentów^[60][61][62].

Przeciwciała blokujące CTLA-4, a przez to zwiększające aktywację limfocytów, wykorzystuje się w leczeniu nowotworów^[63][64]. Przykładem takiego leku jest ipilimumab, stosowany w leczeniu czerniaka złośliwego^[65]. Badania wskazują, że efekty blokowania CTLA-4 w chorobach nowotworowych mogą być jeszcze silniejsze, gdy zostaną użyte przeciwciała blokujące również inne supresyjne szlaki sygnałowe, np. zależne od cząsteczek PD-1^[66] lub CD73^[67]. Efekt terapeutyczny przeciwciał anty-CTLA-4 może być zależny od wariantu genu CTLA4 występującego u danego pacjenta^[68].

W chorobach autoimmunizacyjnych stosuje się białka fuzyjne CTLA-4, które działają podobnie jak rozpuszczalna forma CTLA-4, tzn. blokują CD80 i CD86, nie dopuszczając tym samym do interakcji pomiędzy tymi cząsteczkami a CTLA-4 na powierzchni limfocytów. Przykładami białek fuzyjnych CTLA-4 są belatacept i abatacept. Stosowane są w transplantologii^[69] oraz w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów^[70] i młodzieńczego idiopatycznego zapalenia stawów^[71].