Penetapan histologi

Untuk melaksanakan peranan perlindungannya, fiksatif menyahaslikan protein melalui proses penggumpalan, proses pembentukan pembentukan sebatian aditif atau gabungan kedua-dua proses tersebut. Sebatian yang bertindak balas secara kimia ke makromolekul menstabilkan struktur dengan paling berkesan jika ia dapat bergabung dengan beberapa bahagian di antara dua makromolekul yang berbeza, dan kesan ini dikenali sebagai pautan silang. Penetapan tisu dilakukan atas beberapa sebab. Sebab utamanya adalah untuk membunuh tisu supaya pereputan postmortem (autolisis dan pembusukan) dicegah.^[1] Penetapan mengekalkan bahan biologi (tisu atau sel) sehampir mungkin dengan keadaan semula jadi dalam proses menyediakan tisu untuk pemeriksaan. Untuk mencapai hal ini, beberapa keadaan biasanya mesti dipenuhi.

Yang pertama, fiksatif biasanya bertindak untuk melumpuhkan biomolekul intrinsik—terutamanya enzim proteolitik—yang sebaliknya mencerna atau merosakkan sampel.

Yang kedua, fiksatif biasanya melindungi sampel daripada kerosakan ekstrinsik. Fiksatif adalah toksik terhadap kebanyakan mikroorganisma yang biasa dijumpai (khususnya bakteria) yang mungkin wujud pada sampel tisu atau yang berkemungkinan mengkoloni tisu yang ditetapkan. Di samping itu, banyak fiksatif mengubah bahan yang ditetapkan secara kimia untuk menjadikannya kurang enak (sama ada tidak boleh dihadam atau toksik) terhadap mikroorganisma oportunistik.

Akhirnya, fiksatif sering mengubah sel atau tisu pada tahap molekul untuk meningkatkan kekuatan atau kestabilan mekanikalnya. Peningkatan kekuatan dan ketegaran ini boleh membantu mengekalkan morfologi (bentuk dan struktur) sampel semasa ia diproses untuk analisis selanjutnya.

Seteliti mana pun sesuatu proses penetapan tetap dapat mengubah sampel dan memperkenalkan artifak yang boleh mengganggu tafsiran ultrastruktur selular. Contoh yang ketara ialah mesosom bakteria, yang dianggap sebagai organel pada bakteria gram-positif pada tahun 1970-an, tetapi kemudiannya ditunjukkan oleh teknik baru yang dibangunkan untuk mikroskop elektron hanya sebagai artifak penetapan kimia.^[2][3] Pemiawaian proses penetapan dan lain-lain prosedur pemprosesan tisu mengambil kira pengenalan artifak ini, dengan menetapkan prosedur yang memperkenalkan jenis artifak. Penyelidik yang mengetahui jenis artifak yang dijangka wujud pada setiap jenis tisu dan teknik pemprosesan boleh mentafsir keratan tisu yang mempunyai artifak dengan tepat atau memilih teknik yang meminimumkan artifak kepada kawasan tisu yang ingin dikaji.

Proses penetapan biasanya merupakan peringkat pertama dalam proses berbilang langkah untuk menyediakan sampel bahan biologi bagi tujuan mikroskopi atau analisis lain. Oleh itu, pilihan bahan fiksatif dan protokol penetapan mungkin bergantung pada langkah pemprosesan tambahan dan analisis akhir yang dirancang. Contohnya, imunohistokimia menggunakan antibodi yang mengikat sasaran protein tertentu. Penetapan yang berpanjangan boleh menutup sasaran ini secara kimia dan menghalang pengikatan antibodi. Dalam kes ini, kaedah 'penetapan pantas' menggunakan formalin sejuk selama kira-kira 24 jam biasanya digunakan. Metanol (100%) juga boleh digunakan untuk penetapan cepat, dan masa yang perlu ditentukan itu mungkin berbeza-beza bergantung pada bahan biologi. Sebagai contoh, sel kanser payudara manusia MDA-MB 231 boleh ditetap selama 3 minit sahaja dengan metanol sejuk (-20 °C). Untuk kajian penyetempatan enzim, tisu hendaklah sama ada dipratetapkan secara ringan sahaja, atau dipascatetapkan selepas produk aktiviti enzim terbentuk.

Secara umum terdapat tiga jenis proses penetapan bergantung kepada sampel yang perlu ditetapkan.

Penetapan haba digunakan untuk penetapan organisma sel tunggal, kebiasaannya bakteria dan arkea. Organisma biasanya bercampur dengan air atau larutan garam fisiologi yang membantu menyebarkan sampel secara merata. Setelah dicairkan, beberapa titik sampel dilumurkan ke atas slaid mikroskop. Sampel bakteria cair ini biasanya dirujuk sebagai "calitan" selepas ia diletakkan di atas slaid. Selepas calitan itu telah kering pada suhu bilik, slaid tersebut dikapit dengan penyepit atau penyepit pakaian dan melalui atas nyalaan penunu Bunsen beberapa kali untuk proses bunuh-secara-haba dan melekatkan organisma pada slaid tersebut. Peranti penunumikroan juga boleh digunakan. Selepas proses pemanasan tersebut, sampel biasanya diwarnakan dan kemudian diimej menggunakan mikroskop. ^[4] Penetapan haba secara amnya mengekalkan morfologi keseluruhan tetapi bukan struktur dalaman. Haba menyahaslikan enzim proteolitik dan menghalang autolisis. Penetapan haba tidak boleh digunakan dalam kaedah pewarnaan kapsul kerana penetapan haba akan mengecut atau memusnahkan kapsul (glikokaliks) sehingga tidak dapat dilihat dalam sampel terwarna. ^[5]

Perendaman boleh digunakan untuk menetapkan sampel histologi dari satu sel sehingga ke keseluruhan organisma. Sampel tisu direndam dalam larutan fiksatif untuk tempoh masa yang ditetapkan. Larutan fiksatif mestilah mempunyai isi padu sekurang-kurangnya 10 kali lebih besar daripada isipadu tisu. ^[6] Untuk penetapan berjaya, fiksatif mesti meresap ke seluruh tisu, jadi saiz dan ketumpatan tisu, serta jenis fiksatif mesti dipertimbangkan. Ini adalah teknik biasa untuk aplikasi selular, tetapi boleh digunakan untuk tisu yang lebih besar juga. Menggunakan sampel yang lebih besar bermakna ia mesti direndam lebih lama untuk fiksatif mencapai tisu yang lebih dalam. ^[7]

 

Perfusi ialah laluan cecair melalui saluran darah atau saluran semula jadi organ atau organisma. Dalam penetapan tisu melalui perfusi, fiksatif dipam ke dalam sistem peredaran darah, biasanya melalui jarum yang dimasukkan ke dalam ventrikel kiri. Hal ini dapat dilakukan melalui bimbingan ultrasound, atau dengan membuka rongga dada subjek tersebut.^[8] Fiksatif disuntik ke dalam jantung dengan isi padu suntikan sepadan dengan keluaran jantung biasa. Menggunakan sistem peredaran semula jadi, fiksatif diedarkan ke seluruh badan, dan tisu tidak mati sehingga ia ditetapkan. Apabila kaedah ini digunakan, port saliran juga mesti ditambah pada suatu kedudukan dalam sistem peredaran darah untuk mengambil kira penambahan isipadu larutan fiksatif dan larutan penimbal, kebiasaannya dilakukan di atrium kanan. Fiksatif dipam ke dalam sistem peredaran darah sehingga ia telah menggantikan semua darah. Penggunaan perfusi mempunyai kelebihan dari segi memelihara morfologi,^[9] tetapi kelemahannya ialah subjek mati dan jumlah fiksatif yang diperlukan untuk organisma yang lebih besar adalah tinggi, berpotensi meningkatkan kos. Pengurangan jumlah cecair yang diperlukan juga boleh dilakukan untuk melakukan penetapan perfusi melalaui pencubitan arteri yang bersambung tisu yang tidak berkepentingan dalam penyelidikan yang terlibat. Penetapan perfusi biasanya digunakan untuk pengimejan otak, paru-paru, dan tisu buah pinggang dalam tikus, dan juga digunakan pada proses autopsi manusia.^[7][10]

Dalam kedua-dua proses penetapan rendaman dan perfusi, bahan fiksatif kimia digunakan untuk mengekalkan struktur dalam keadaan (dari segi sifat kimia dan struktur) sedekat mungkin dengan tisu hidup. Hal ini memerlukan fiksatif kimia.

Fiksatif penghubung silang bertindak dengan mencipta ikatan kimia kovalen antara protein pada tisu. Hal ini menambat protein larut pada sitoskeleton, dan memberikan ketegaran tambahan pada tisu. Pemeliharaan struktur sitoskeleton sementara atau halus seperti pengecutan semasa gelombang pembezaan embrio boleh dilakukan terbaik menggunakan kaedah prarawatan menggunakan gelombang mikro sebelum penambahan fiksatif penghubung silang.^[11][12]

Fiksatif yang paling biasa digunakan dalam histologi ialah formaldehid. Ia biasanya digunakan sebagai 10% formalin tertimbal neutral (NBF), iaitu lebih kurang 3.7%–4.0% formaldehid dalam penimbal fosfat, pH 7. Memandangkan formaldehid ialah gas pada suhu bilik, formalin–gas formaldehid terlarut dalam air (~37% w/v) – digunakan semasa membuat fiksatif tersebut. Formaldehid membetulkan tisu dengan menghubungkan silang protein, terutamanya sisa-sisa asid amino asas lisin. Kesannya boleh diterbalikkan dengan air berlebihan dan ia mengelakkan pigmentasi formalin. Paraformaldehid juga biasa digunakan dan akan menyahpolimer semula menjadi formalin apabila dipanaskan, juga menjadikannya fiksatif yang berkesan. Faedah lain penggunaan paraformaldehid termasuklah penyimpanan jangka panjang dan penembusan tisu yang baik. Ia amat baik untuk teknik imunohistokimia. Wap formaldehid juga boleh digunakan sebagai fiksatif untuk calitan sel.

Satu lagi aldehid yang popular untuk penetapan ialah glutaraldehid. Ia beroperasi sama seperti formaldehid, menyebabkan pencanggaan protein heliks-α. Walau bagaimanapun glutaraldehid adalah molekul yang lebih besar berbanding formaldehid, maka meresap ke dalam membran lebih perlahan. Akibatnya, penetapan glutaraldehid pada sampel tisu yang lebih tebal boleh menjadi sukar; tetapi masalah ini boleh diatasi dengan mengurangkan saiz sampel tisu. Salah satu kelebihan penetapan glutaraldehid ialah ia mungkin menawarkan produk penetapan yang lebih tegar atau berhubung kait dengan lebih ketat, kerana panjangnya yang lebih besar dan dua kumpulan aldehid membolehkannya 'merapat' dan menghubungkan pasangan molekul protein yang lebih jauh. Glutaraldehid boleh menyebabkan perubahan yang cepat dan tidak dapat dipulihkan, sangat sesuai untuk teknik mikroskop elektron, berfungsi dengan baik pada 4 °C, dan memberikan perincian keseluruhan sitoplasma dan nukleus yang terbaik. Walau bagaimanapun, ia tidak sesuai untuk pewarnaan imunohistokimia.

Sesetengah protokol penetapan memerlukan gabungan formaldehid dan glutaraldehid supaya kekuatan masing-masing saling melengkapi.

Fiksatif penghubung silang ini, terutamanya formaldehid, cenderung untuk mengekalkan struktur sekunder protein dan juga boleh mengekalkan kebanyakan struktur tertier.

Fiksatif pemendakan (atau denaturasi) bertindak dengan mengurangkan keterlarutan molekul protein dan selalunya melalui cara penggangguan interaksi hidrofobik yang terlibat dalam pemberian banyak struktur tertier protein tersebut. Pemendakan dan pengagregatan protein adalah proses yang sangat berbeza berbanding proses penghubung silang yang berlaku dengan fiksatif aldehid.

Fiksatif pemendakan yang paling biasa digunakan ialah etanol dan metanol. Ia biasanya digunakan untuk membaiki bahagian beku dan calitan. Aseton juga digunakan dan telah terbukti menghasilkan pemeliharaan histologi yang lebih baik berbanding penghirisan beku apabila digunakan pada teknik Acetone Methylbenzoate Xylene (AMEX).

Metanol, etanol dan aseton penyahasli protein jarang digunakan secara bersendirian untuk menetapkan blok melainkan mengkaji asid nukleik.

Asid asetik ialah penyahasli yang kadangkala digunakan dalam kombinasi dengan fiksatif pemendakan lain, seperti AFA Davidson.^[13] Alkohol, dengan sendirinya, diketahui menyebabkan pengecutan dan pengerasan tisu yang ketara semasa proses penetapan manakala asid asetik semata-mata dikaitkan dengan pembengkakan tisu; maka penggabungan kedua-dua bahan ini boleh menghasilkan pemeliharaan morfologi tisu yang lebih baik.

Fiksatif pengoksidaan boleh bertindak balas dengan rantai sampingan protein dan biomolekul lain, membolehkan pembentukan pautan silang yang menstabilkan struktur tisu. Walau bagaimanapun, ia menyebabkan penyahaslian yang meluas walaupun dapat mengekalkan struktur halus sel dan digunakan terutamanya sebagai fiksatif sekunder.

Osmium tetroksida sering digunakan sebagai fiksatif sekunder apabila sampel disediakan untuk mikroskop elektron. (Ia tidak digunakan untuk mikroskop cahaya kerana ia menembusi bahagian tebal tisu dengan sangat teruk).

Kalium dikromat, asid kromik, dan kalium permanganat semuanya didapati digunakan dalam sediaan histologi tertentu.

Larutan bermerkuri seperti B-5 dan fiksatif Zenker mempunyai mekanisme yang tidak diketahui yang meningkatkan kecerahan pewarnaan dan memberikan butiran nukleus yang sangat baik. Walaupun cepat, merkuri menembusi dengan cara yang buruk dan menghasilkan pengecutan tisu. Aplikasi terbaik larutan ini adalah untuk penetapan tisu hematopoietik dan retikuloendotelial. Perlu diambil perhatian bahawa disebabkan ia mengandungi merkuri, langkah berjaga-jaga mesti diambil sewaktu pelupusan.

Pikrat menembusi tisu dengan baik untuk bertindak balas dengan histon dan protein asas untuk membentuk pikrat berhablur dengan asid amino dan memendapkan semua protein. Ia adalah fiksatif yang baik untuk tisu penghubung, memelihara glikogen dengan baik, dan mengekstrak lipid untuk memberikan hasil yang lebih baik berbanding formaldehid dalam proses pewarnaan imuno bagi hormon-hormon biogenik dan polipeptida. Walau bagaimanapun, ia menyebabkan kehilangan basofil melainkan spesimen dibasuh dengan teliti selepas penetapan.

Kesan perlindungan pelarut organik yang dimediasi penimbal hepes-asid glutamik (HOPE) memberikan morfologi seakan formalin, pemeliharaan antigen protein yang sangat baik untuk imunohistokimia dan histokimia enzim, hasil RNA dan DNA yang baik serta ketiadaan protein penghubung silang.

• FIksatif Karnovsky
• Formalin
• Formaldehid
• Glutaraldehid

• Membaiki spesimen untuk membuat slaid kekal
• Strategi penetapan dan formulasi untuk pewarnaan imunohistokimia