Immunfluoreszcencia

Az immunfluoreszcencia hisztokémiai festési technika, melynek célja az antigén-antitest kötődés létrejöttének megállapítása szövetekben. Az eljárás alapvetőnek számít klinikai vagy hisztopatológiai vizsgálatoknál számos rendellenesség feltárásában. A metódust Coons és munkatársai fedezték fel 1941-ben, amit később Beutner és Jordon fejlesztettek tovább, illetve ennek speciális változatát - az indirekt immunfluoreszcenciát.

Klinikai immundermatológiában három alaptípusát különböztetjük meg az IF technikának:  a közvetlen immunfluoreszcencia, a már említett indirekt immunfluoreszcencia (IIF) és a komplement-kapcsolt indirekt immunfluorszecencia. Mindegyike ezeknek fluoreszein kötött antitest-immunglobulin komplexet, komplement komponenseket vagy más fehérjéket használ fel az eljárás során. A detektálás alapja a fluoreszcens indikátorral ellátott vírusspecifikus antitest – antigén kötődés.

A direkt immunfluoreszcencia (DIF) fluoreszcens anyaggal kapcsolat antitesteket használ, amely közvetlen a szöveti antigénhez köt. A felhasznált célszövetet először tisztítják, gyorsfagyasztják, majd 5 – 6 μm méretű szeletekre vágják és üveglapra helyezve, fluoreszcens antitestekkel (IgA, IgG, IgM) ellátott oldattal inkubálják, melyek a célantigénre szenzitívek. A komplexet – megfelelő koncentrációban – a szövetre viszik fel, majd a kötődő fluoreszcens antitesteket megfelelő módon detektálják. A módszer előnye, hogy viszonylag gyors, specifitása széleskörű, emellett azonban sajnos kevésbé érzékeny, mint számos más mikrobiológiai technika.

Az indirekt immunfluoreszcencia (IIF) a preparátumot először egy specifikus, de nem jelzett immunglobulin oldatban, majd fluoreszcens festékkel jelzett anti-immunglubulin oldattal inkubálják. Vagyis a célfehérjét előbb jelöletlen antitesttel, majd a fluoreszcens – az első antitest elleni második ellenanyaggal kezelik. Megjegyzendő, hogy az indirekt immunfluoreszcencia autoantitestek kimutatására használatos elsősorban, a pontosabb detektálás érdekében például ELISA technikát alkalmaznak.

A módszer legfontosabb kívánalma az ún. fluorokróm vagy fluorofór, mely bizonyos hullámhosszúságon fényelnyelő, s azt egy másik, nagyobb hullámhosszúságon visszasugározza. Jelenleg olyan fluorokrómok léteznek, melyek mind az ibolyántúli -, mind pedig az infra közeli tartományban érzékenyek. A legszembetűnőbb előnye ennek a módszernek a viszonylagos érzékenység és a jó szelektivitási képesség. Itt utalunk arra, hogy a szóban forgó eljárást a kezdetekben nem kifejezetten diagnosztikai célra, sőt nem is a mikrobiológia tudományterületén alkalmazták. Ezt követően azonban a molekuláris biológia ugrásszerű fejlődésével együtt más hasonló analitikai és mikrobiológiai elemző metódusokkal egyetemben igen gyors fejlődésnek indult a fluoreszcencia mikroszkópia is. Ennek egyik eklatáns példája Shimomura, Chalfie és Tsien úttörő munkája fluoreszcens fehérjék kutatásában (Nobel-díj, 2008). A fluoreszcencia mikroszkópia alkalmazásának széleskörű használhatóságát mindaddig alulbecsülték, míg a szimpla analitikai és diagnosztikai alkalmazásmód mellett az in situ komplex sejtfiziológiai szintézis lehetősége, ezzel együtt az eljárásnak más tudományterületekre történő eljutása az évtizedek alatt realitássá nem vált.

Egy fluoreszcens mikroszkópiával készült kép általában a kérdéses molekulastruktúra térbeli elhelyezkedéséről, vagy annak szerkezetéről ad felvilágosítást. Vegyünk példaként egy fluoreszcensen festett fibroblasztból származó mikrotubulust. Ekkor a megfigyelő megállapíthatja, hogy például egy adott sejtnek egy bizonyos pontján a szóban forgó képlet szerepel vagy nem. A fluoreszcens jelnek lokális intenzitása ebben az esetben nem a tubulinkoncentráció egzakt mértékéül szolgál, ugyanis az nagyban függ a fókusz síkjától. Ugyancsak megnehezíti vagy ellehetetleníti a pontos információszerzés lehetőségét a tény, mely szerint a festés nem egységes, ugyanis az érintett antitest más fehérjék által térben árnyékolttá válhat. Ennek alapján azt mondható, hogy az általános kép csupán a mikrotubulus hálózat architektúrájába enged betekintést. A módszert ezért gyakran más eljárással egészítik ki, mint például széles látóterű fluoreszcens vagy konfokális pásztázó mikroszkóp használatával.

A mérés kissé bonyolult, mert az objektív mozgatása a vizsgált mintához viszonyítva nem szükségszerűen módosítja a távolságot a mintában a létrejött kép síkjához viszonyítva, amely az ún. gömbi eltérést okozza. A hatás víz alapú immerziós lencsék esetén kevésbé tapasztalható. Az optikai tengely mentén történő megfelelő kalibráció hasznos lehet, ha visszaverő felszínt alkalmazunk. Az sem segít sokat, ha bizonyos mérettartomány elérhetővé tételét a diffrakció korlátozásával próbáljuk ebben az esetben elérni. A minta síkjában az objektum térviszonyai, ha az a hullámhossz felénél kisebb nagyságrendbe tartoznak, nem azonosíthatók már. Az optikai tengely mentén a hosszirányú mérések legalább háromszor gyengébb feldolgozást adnak, mint általában.

• Immunológia
• Mikroszkópia

• Kubitscheck, Ulrich. Fluorescence Microscopy : from principles to biological applications. Weinheim: Wiley (2013). ISBN 978-1-299-46465-0 
• http://nos.org/media/documents/dmlt/Microbiology^{[halott link]}
• Kelly Cude, Kelly Burke: Introduction to Fluorescence Microscopy / www.canyons.edu