Mala interferirajuća RNK

 

Prirodne siRNK imaju dobro definiranu strukturu koja je kratka (obično 20 do 24-bp) dvolančana RNK (dsRNA) sa fosforiliranim krajevima od 5' i hidroksiliranim 3' završava se sa dva dodatna nukleotida. Dicer enzim katalizuje proizvodnju siRNA iz dugih dsRNK i malih pin RNK.^[3] siRNA se također mogu uvesti u ćelije transfekcijom. Budući da se u principu svaki gen može nokdaunirati sintetskom siRNK sa komplementarnom sekvencom, siRNK su važan alat za validaciju funkcije gena i ciljanja lijekova u postgenomskoj eri.

Mehanizam kojim prirodna siRNK uzrokuje utišavanje gena potiskivanjem translacije odvija se na sljedeći način:

 

1. Dugolančana dsRNK (koja može doći od ukosnice, komplementarnih RNK i RNK ovisnih o RNK-polimerazama) cijepa se endoribonukleazom zvanom Dicer. Dicer siječe dugolančanu dsRNK da bi formirao kratku interferirajuću RNK ili siRNA; to je ono što omogućava molekulima da formiraju RNK-inducirani kompleks utišavanja (RISC).
2. Kada siRNK uđe u ćeliju, ugrađuje se u druge proteine kako bi formirala RISC.
3. Jednom kada je siRNK dio kompleksa RISC, odmotava se i formira jednolančanu siRNK.
4. Sekvenca koja je termodinamički manje stabilna zbog svog uparivanja baza na 5´kraju je odabran da ostane dio RISC-kompleksa
5. Jednolančana siRNK koja je dio RISC kompleksa sada može skenirati i pronaći komplementarnu iRNK
6. Jednom kada se jednolančana siRNK (dio RISC kompleksa) veže za svoju ciljnu iRNL, inducira cijepanje iRNK.
7. iRNK je sada isječena i ćelija prepoznata kao abnormalna. Ovo uzrokuje degradaciju iRNK i zauzvrat nema translacije iRNK u aminokiseline, a zatim u proteine. Tako se utišava gen koji kodira tu iRNK.

siRNK je također slična miRNK; međutim, miRNK izvedene su iz kraćih RNK proizvoda matične petlje, tipski utišavajući gene potiskivanjem translacije i imaju širu specifičnost djelovanja, dok siRNK obično djeluju tako što cijepaju iRNK prije translacije i imaju 100% komplementarnost, što znači vrlo čvrstu ciljanu specifičnost.^[4][5]

 

Transfekcija nokdaunom gena egzogene siRNK je često nezadovoljavajuća jer je efekt samo prolazan, posebno u ćelijama koje se brzo dijele. Ovo se može prevazići stvaranjem ekspresijskog vektora za siRNK. Sekvenca siRNK modificirana je, kako bi se uvela kratka petlja između dva lanca. Rezultirajući transkript je kratolančana RNK (shRNK), koju Dicer može obraditi u funkcionalnu siRNK na svoj uobičajeni način.^[6] Tipiske transkripcijske kasete koriste promotor RNK-polimeraze III (npr. U6 ili H1) za usmjeravanje transkripcije malih jedarnih RNK (snRNK) (U6 je uključen u splajsing gena; H1 je RNazna komponenta ljudske RNKaze P). Teoretizira se da rezultirajući transkript siRNK zatim obrađuje Dicer.

Efikasnost nodauna gena se takođe može poboljšati korišćenjem stiskanja ćelija.^[7]

Aktivnost siRNK u RNKi u velikoj mjeri ovisi o njegovoj sposobnosti vezivanja za RNK-inducirani kompleks utišavanja (RISC). Vezanje dupleksa siRNK za RISC praćeno je odmotavanjem i cijepanjem sens lanca pomoću endonukleaza. Preostali anti-sens lanac-RISC kompleks se tada može vezati za ciljane mRNK za iniciranje utišavanja transkripcije.^[8]

Utvrđeno je da dsRNK također može aktivirati ekspresije gena, mehanizam koji je nazvan "mala RNK-indukovana aktivacija gena" ili RNKa. Pokazalo se da dsRNK ciljane na promotore gena induciraju moćnu transkripcijsku aktivaciju povezanih gena. RNKa je demonstrirana u ljudskim ćelijama, korištenjem sintetskih dsRNK, zvanih "male aktivirajuće RNK" (saRNK). Do sada nije poznato koliko je RNKa konzervirana u drugim organizmima.^[9] Jedan izvještaj u komarcu Aedes aegypti pokazao je da postoje dokazi za RNKa i mogu se postići kratkim ili dugim dsRNK, ciljajući na promotorske regije.^[10]

Utišavanje gena nakon transkripcije izazvano putem siRNK počinje sastavljanjem RNK-indukovanog kompleksa utišavanja (RISC). Kompleks utišava određenu ekspresiju gena, cijepanjem molekula iRNK koje kodiraju ciljne gene. Za početak procesa, jedan od dva lanca siRNK, vodeći lanac (anti-sense lanac), bit će učitan u RISC dok se drugi lanac, putnički lanac (sens lanac), degradira. Za učitavanje vodiča u RISC mogu biti odgovorni određeni Dicer enzimi.^[11] Zatim, siRNK skenira i usmjerava RISC na savršeno komplementarnu sekvencu na molekulama iRNK.^[12] Smatra se da cijepanje molekula iRNK katalizira Piwi domen argonautskih proteina RISC-a. Molekula iRNK se zatim precizno siječe cijepanjem fosfodiestarske veze između ciljnih nukleotida koji su upareni sa ostacima siRNK 10 i 11, računajući od 5' kraja.^[13] Ovo cijepanje rezultira fragmentima iRNK koji se dalje razgrađuju ćelijskim egzonukleazama. 5' fragment je degradiran sa svog 3' kraja pomoću egzosoma, dok je 3' fragment degradiran sa svog 5' kraja od 5' -3' egzoribonukleaze 1 (XRN1).^[14]

Ponekad ne dođe do cijepanja ciljne molekule iRNK. U nekim slučajevima, endonukleolitsko cijepanje fosfodiestarske kičme može biti potisnuto neusklađenošću siRNK i ciljne mRNK u blizini mjesta cijepanja. U drugim slučajevima, proteini argonautskog RISC-a nemaju aktivnost endonukleaza čak i kada su ciljna mRNK i siRNK savršeno uparene. U takvim slučajevima, ekspresija gena će biti utišana mehanizmom izazvanom putemmiRNK^[12]

 

^[2]

Piwi-interaktivne RNK odgovorne su za utišavanje transpozona i nisu siRNK.^[15] PIWI-interragirajuće RNK (piRNK) su nedavno otkrivena klasa malih nekodirajućih RNK (ncRNK) dužine od 21–35 nukleotida. Oni imaju ulogu u regulaciji ekspresije gena, utišavanju transpozona i inhibiciji virusne infekcije. Nekada smatrane kao "tamna materija" ncRNK, piRNK pojavile su se kao važni faktori u višestrukim ćelijskim funkcijama u različitim organizmima.^[16]

Alternativno, siRNK mogu se ugraditi u kompleks RNK-inducirano utišavanje transkripcije (RITS). Aktivni RITS kompleks će pokrenuti formiranje heterohromatina oko DNK koji odgovara siRNK, efektivno utišavajući gene u toj regiji DNK.

Uvođenje previše siRNK može rezultirati nespecifičnim događajima zbog aktivacije urođenih imunskih odgovora.^[17] Većina dosadašnjih dokaza sugerira da je to vjerovatno zbog aktivacije dsRNK senzora PKR, iako može biti uključen i gen I koji inducira retinojsku kiselinu (RIG-I).^[18] Također opisana je i indukcija citokina putem receptora 7 (TLR7) sličnog tollu. Hemijska modifikacija siRNA se koristi za smanjenje aktivacije urođenog imunskog odgovora za funkciju gena i terapijske primjene. Jedan obećavajući metod za smanjenje nespecifičnih efekata je pretvaranje siRNK u mikroRNK.^[19] MikroRNA se javljaju prirodno, a korištenjem ovog endogenog puta trebalo bi biti moguće postići sličan nokdown gena pri relativno niskim koncentracijama rezultirajućih siRNA. Ovo bi trebalo da minimizira nespecifične efekte.

Obične RNK mogu biti slabi imunogeni, ali se lahko mogu stvoriti antitijela protiv kompleksa RNK-protein. Mnoge autoimunske bolesti imaju ove tipove antitijela. Još uvijek nema izvještaja o antitijelima protiv siRNK vezanih za proteine. Neki metodi za isporuku siRNK povezuju polietilen-glikol (PEG) s oligonukleotidom smanjujući izlučivanje i poboljšavajući poluživot u cirkulaciji. Međutim, nedavno je Regado Biosciences morao prekinuti veliko ispitivanje faze III PEGiliranog RNK aptamera protiv faktora IX, zbog teške anafilaksne reakcije na PEG dio RNK. Ova reakcija je u nekim slučajevima dovela do smrti i izaziva značajnu zabrinutost oko isporuke siRNK kada su uključeni PEGilirani oligonukleotidi.^[20]

 

siRNK su hemijski modificirane, kako bi se poboljšala njihova terapeutska svojstva, kao što su poboljšana aktivnost, povećana stabilnost seruma, manje odstupanja od cilja i smanjena imunska aktivacija. Obično je siRNK inkapsulirana u nanolipidnu česticu kako bi se spriječila degradacija u krvi. Detaljna baza podataka o svim takvim hemijskim modifikacijama je u naučnoj literaturi ručno uređena kao siRNAmod.^[21] Hemijska modifikacija siRNK također može nenamjerno dovesti do gubitka specifičnosti jednog nukleotida.^[22]

Unutarćelijske isporuke siRNK i dalje predstavlja izazov. Postoje tri glavne tehnike isporuke siRNA koje se razlikuju po efikasnosti i toksičnosti.

U ovoj tehnici siRNK prvo mora biti dizajnirana protiv ciljnog gena. Jednom kada je siRNK konfigurisana prema genu, ona mora biti efikasno isporučena putem transfekcijskog protokola. Dostava se obično vrši pomoću kationskih liposoma, polimernih nanočestica i konjugacije lipida.^[23] Ovaj metod je povoljan jer može isporučiti siRNK u većinu tipova ćelija, ima visoku efikasnost i reproduktivnost i nudi se komercijalno. Najčešći komercijalni reagensi za transfekciju siRNK su lipofektamin i neonska transfekcija. Međutim, nije kompatibilan sa svim tipovima ćelija i ima nisku efikasnost in vivo.^[24][25]

Električni impulsi se također koriste za unutarćelijsku isporuku siRNK. Ćelijska membrana je građena od fosfolipida, što je čini osjetljivom na električno polje. Kada se pokrenu brzi, ali snažni električni impulsi, molekule lipida se preorijentišu, dok prolaze kroz termalne fazne prijelaze zbog zagrijavanja. Ovo rezultira stvaranjem hidrofilnih pora i lokaliziranim poremećajima u membrani ćelijskih lipidnih dvoslojeva, što također uzrokuje privremeni gubitak polupropusnosti. Ovo omogućava izlazak mnogih unutarćelijskih sadržaja, kao što su ioni i metaboliti, kao i istovremeni unos lijekova, molekulskih sondi i nukleinskih kiselina. Za ćelije koje je teško transficirati, elektroporacija je korisna, ali ćelijska smrt je vjerojatnija pod ovom tehnikom.^[26]

Ovaj metod korišten je za isporuku siRNK koja cilja VEGF u ksenotransplantne tumore golih miševa, što je rezultiralo značajnom supresijom rasta tumora.^[27]

Efekti utišavanja gena transficirane dizajnirane siRNK su općenito prolazni, ali ova poteškoća može se prevazići putem RNKi pristupa. Isporuka ove siRNK iz DNK šablona može se obaviti putem nekoliko rekombinantnih virusnih vektora, zasnovanih na retrovirusu, adeno-asociranom virusu, adenovirusi i lentivirusu.^[28] Potonji je najefikasniji virus koji stabilno isporučuje siRNK ciljnim ćelijama jer može transducirati ćelije koje se ne dijele, kao i direktno ciljati ćelijsko jedro.^[29] Ovi specifični virusni vektori sintetizovani su da efikasno olakšaju siRNK koja nije održiva za transfekciju u ćelije. Drugi aspekt je da u nekim slučajevima sintetski virusni vektori mogu integrirati siRNK u ćelijski genom, što omogućava stabilnu ekspresiju siRNk i dugotrajno utišavanje gena. Ova tehnika je korisna jer je i in vivo i efikasna za ćelije koje je teško transficirati. Međutim, nastaju problemi jer može izazvati antivirusne odgovore u nekim tipovima ćelija, što dovodi do mutagenih i imunskih efekata.

Ovaj metod ima potencijalnu upotrebu u utišavanju gena centralnog nervnog sistema za liječenje Huntingtonove bolesti.^[30]

• Genski nokdaun
• Utišavanje gena
• Sinteza oligonukleotida
• EsiRNK
• NatsiRNK
• Viroid
• CRISPR
• Darmakon
• Persomika

 

Commons ima datoteke na temu: Mala interferirajuća RNK

Šablon:Prirodni antisens transkripti